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domingo, 6 de mayo de 2012

6.2 Organismos eucarióticos:


Transcripción en eucariotas
En el caso de las eucariotas, el proceso se realiza en el núcleo, y es similar al de las procariotas, pero de mayor complejidad. Diferentes ARNp transcriben distintos tipos de genes. La ARNpII transcribe los pre-ARNm, mientras que la ARNpI y ARNpIII transcriben los ARN-ribosomales y ARNt, respectivamente. Los ARNs transcritos son modificados posteriormente. El pre-ARNm,por ejemplo, sufre un proceso de maduración que tras cortes y empalmes sucesivos elimina ciertos segmentos del ADN llamados los intrones para producir el ARNm final. Durante este proceso de maduración se puede dar lugar a diferentes moléculas de ARN, en función de diversos reguladores. Así pues, un mismo gen o secuencia de ADN, puede dar lugar a diferentes moléculas de ARNm y por tanto, producir diferentes proteínas. Otro factor de regulación propio de las células eucariotas son los conocidos potenciadores (en inglés: "enhancers"), que incrementan mucho (100 veces) la actividad de transcripción de un gen, y no depende de la ubicación de éstos en el gen, ni la dirección de la lectura.
Etapas de la transcripción
Clásicamente se divide el proceso de la transcripción en 3 etapas principales (iniciación, elongación y terminación), pero realmente se pueden diferenciar 5 etapas :
Preiniciación
Al contrario de la replicación de ADN, durante el inicio de la transcripción no se requiere la presencia de un cebador para sintetizar la nueva cadena, de ARN en este caso. Antes del inicio de la transcripción se necesitan toda una serie de factores de transcripción que ejercen los factores de iniciación. Estos se unen a secuencias específicas de ADN para reconocer el sitio donde la transcripción ha de comenzar y se sintetice el ARN cebador. Esta secuencia de ADN en la que se ensamblan los complejos de transcripción se llama promotor. Los promotores se localizan en los extremos 5'-terminales de los genes, antes del comienzo del gen, y a ellos se unen los factores de transcripción mediante fuerzas de Van der Waals yenlaces de hidrógeno. Los promotores tienen secuencias reguladoras definidas, muy conservadas en cada especie, donde las más conocidas son la caja TATA (situada sobre la región -10), con la secuencia consenso TATA(A/T)A(A/T); y la caja TTGACA (situada en el punto -35). La formación del complejo de transcripción se realiza sobre el promotor TATA, allí se forma el núcleo del complejo de iniciación. Sobre la caja TATA se fija una proteína de unión (TBP) junto con el factor de transcripción TFII D (TF proviene del inglés: transcription factor). Después, a ellos se unen otros factores de transcripción específicos: TFII A, que estabiliza el complejo TFII D-ADN; los factores TFII B y TFII E se unen al ADN y el TFII F (una helicasadependiente de ATP) y al final la ARN polimerasa. Todo ello forma un complejo que se llama complejo de preiniciación cerrado. Cuando la estructura se abre por mediación del factor de transcripción TFII H, da comienzo la iniciación..
Iniciación
Primero, una Helicasa separa las hebras de ADN en estas denominadas cajas TATA, ya que entre adenina y timina se establecen dos enlaces de hidrógeno, mientras que entre citosina y guanina se forman tres. Posteriormente se unen los factores y las proteinas de transcripción (TBP, TF2D, TF2B) permitiendo, de esta manera, el acceso de la ARN polimerasa al molde de ADN de cadena simple, siendo esta la ultima en posicionarse. Aunque la búsqueda del promotor por la ARN polimerasa es muy rápida, la formación de la burbuja de transcripción o apertura del ADN y la síntesis del cebador es muy lenta. La burbuja de transcripción es una apertura de ADN desnaturalizado de 18 pares de bases, donde empieza a sintetizarse el ARN cebador a partir del nucleótido número 10 del ADN molde de la burbuja de transcripción. La burbuja de transcripción se llama complejo abierto. La ARN polimerasa es una enzima formada por 5 subunidades: 2 subunidades α, 1 subunidad β, 1 subunidad β' y 1 subunidad ω que tiene como función la unión de ribonucleótidos trifosfato. Cuando se forma el complejo abierto, la ARN polimerasa comienza a unir ribonucleótidos mediante enlaces fosfodiéster, y una vez que se forma el primer enlace fosfodiéster, acaba la etapa de iniciación.y comienza asi la siguiente etapa.
Disgregación del promotor
Una vez sintetizado el primer enlace fosfodiéster, se debe deshacer el complejo del promotor para que quede limpio para volver a funcionar de nuevo. Durante esta fase hay una tendencia a desprenderse el transcrito inicial de ARN y producir transcritos truncados, dando lugar a una iniciación abortada, común tanto en procariontes como eucariontes. Una vez que la cadena transcrita alcanza una longitud de unos 23 nucleótidos, el complejo ya no se desliza y da lugar a la siguiente fase, la elongación.
La disgregación del promotor coincide con una fosforilación de la serina 5 del dominio carboxilo terminal de la ARN polimerasa, que es fosforilado por el TFII H (que es una proteínaquinasa dependiente de ATP)
Elongación
La ARN polimerasa cataliza la elongación de cadena del ARN. Una cadena de ARN se une por apareamiento de bases a la cadena de ADN, y para que se formen correctamente los enlaces de hidrógeno que determina el siguiente nucleótido del molde de ADN, el centro activo de la ARN polimerasa reconoce a los ribonucleótidos trifosfato entrantes. Cuando el nucleótido entrante forma los enlaces de hidrógeno idóneos, entonces la ARN polimerasa cataliza la formación del enlace fosfodiéster que corresponde. A esto se le llama elongación, la segunda etapa de la transcripción del ARN.
Terminación
Al finalizar la síntesis de ARNm, esta molécula ya se ha separado completamente del ADN (que recupera su forma original) y también de la ARN polimerasa, terminando la transcripción. La terminación es otra etapa distinta de la transcripción, porque justo cuando el complejo de transcripción se ha ensamblado activamente debe desensamblarse una vez que la elongación se ha completado. La terminación está señalizada por la información contenida en sitios de la secuencia del ADN que se está transcribiendo, por lo que la ARN polimerasa se detiene al transcribir algunas secuencias especiales del ADN. Estas secuencias son ricas en guanina y citosina, situadas en el extremo de los genes, seguidas de secuencias ricas en timina, formando secuencias palindrómicas, que cuando se transcriben el ARN recién sintetizado adopta una estructura en horquilla que desestabiliza el complejo ARN-ADN, obligando a separarse de la ARN polimerasa, renaturalizándose la burbuja de transcripción. Algunas secuencias de ADN carecen de la secuencia de terminación, sino que poseen otra secuencia a la que se unen una serie de proteínas reguladoras específicas de la terminación de la transcripción como rho 















ARNm EUCARIOTA
1- La mayoría de los ARNm eucariotas presentan la secuencia del mensaje interrumpida, es decir coexisten a lo largo de la molécula sectores que codifican para la proteína llamados EXONES, con secuencias intercaladas sin información denominadas 
INTRONES (Fig. 12.9).



Fig. 11.9 - Estructura en mosaico del ARNm transcripto primario eucariota


2- Los ARNm transcriptos primarios sufren una serie de modificaciones antes de salir al citoplasma como ARNm maduro.
Algunos cambios consisten en el agregado de moléculas en los extremos 5' y 3' llamados capping y poliadenilación.
Capping: Ésta es la denominación del proceso por el cual se adiciona en el extremo 5' del ARNm una molécula de 7 metil-guanosina (un nucleótido metilado) a la que se conoce como cap (del inglés, capuchón). Ésta molécula se agrega al ARNm naciente cuando éste alcanza, aproximadamente, los 30 nucleótidos de longitud. Por ser esta modificación simultánea a la transcripción se la considera co-transcripcional. La cap impide la degradación del ARNm inmaduro por nucleasas y fosfatasas nucleares. También participa en la remoción de intrones y en el inicio de la traducción.

Fig 11.10- El agregado del cap

Poliadenilación: Este proceso consiste en el agregado de alrededor de unas 250 adenosinas
o cola poli A , en el extremo 3' del ARNm. El ARNm presenta una secuencia de
nucleótidos específica AAUAAA conocida como señal de poliadenilación. Una nucleasa corta
al pre-ARNm a unos 20 nucleótidos después de la señal. Una vez liberado el pre-ARNm, la enzima poliA-polimerasa le agrega las adenosinas de a una por vez. Por otra parte la ARN pol II continúa transcribiendo un tramo más del molde, para finalmente disociarse del gen. Este último tramo de ARN es totalmente infructuoso, pues resulta rápidamente degradado por nucleasas y fosfatasas.
Las funciones de la cola poli A son: proteger el extremo 3' de la degradación y ayudar a los ARNm a salir del núcleo.
Carecen de cola poli A los ARNm de histonas, dado que como ya se mencionó, no presentan la señal de poliadenilación. Otra excepción la ejemplifican algunos genes que presentan más de una señal de poliadenilación. Cuando así ocurre, el mismo gen puede ser transcripto en dos productos diferentes, dependiendo de cuál sea la señal reconocida.




Fig. 11.11 - El agregado de la cola poli A


Otra modificación significativa afecta a la secuencia codificadora, que sufre un acortamiento producto de la eliminación de los intrones, quedando como producto final los exones empalmados en secuencia continua. Este tipo de procesamiento se llama empalme (splicing) y fue descubierto en 1977.
Para que se lleve a cabo este tipo de maduración del pre-ARNm se necesita una batería de ribonucleoproteínas nucleares: las RNPpn ( snRNP, del inglés, small nuclear ribonucleoprotein). Estas partículas ricas en uridinas y diversas proteínas se denominan U1, U2, U4, U5, U6 y se combinan de a una por vez en los extremos de cada intrón (lindantes a sendos exones). El complejo resultante del ensamblado de las distintas RPNpn se denomina espliceosoma. La actividad enzimática residiría en los ARNpn del espliceosoma. Éstos serían los responsables de reconocer las secuencias señalizadoras de corte, escindir a los intrones y empalmar a los exones entre ellos, produciendo una molécula de ARNm maduro.
Mecanismo molecular del splicing
El corte de intrones y el empalme de exones deben ser muy exacto, pues de lo contrario un error pequeño, causaría un corrimiento del marco de lectura del ARNm. Los intrones son clivados del transcripto primario por las RNPpn que reconocen cortas secuencias conservadas dentro del intrón y en los límites con los exones. Estas secuencias, muy similares en todos los intrones estudiados, son:
·         Secuencia GU en el extremo 5' o sitio dador
·         Secuencia AG en el extremo 3' del intrón o sitio aceptor
·         Secuencias conocida como sitio de ramificación que se localiza en el interior del intrón
Estas secuencias participan en las reacciones de clivado y empalme que ocurren en dos etapas:
En la primer etapa, una RNPpn reconoce al sitio dador y otra se enlaza al sitio de ramificación. El extremo 5' es clivado y ligado a un nucleótido(A) del sitio de ramificación.
En la segunda etapa, se da el reconocimiento del extremo 3’ por parte de otra RNPpn y se produce el corte en el extremo 3' del intrón, seguido por el empalme de los dos exones. Así se libera el ARNm maduro del espliceosoma. El intrón queda eliminado en forma de lazo y será degradado posteriormente en el núcleo.


  
Fig. 11.12 - Acción del espliceosoma


Como citáramos anteriormente, la presencia del capuchón en el extremo 5' es requerida para que las RNPpn trabajen, no así la cola poli A.
3- Los ARNm maduros son monocistrónicos, es decir el sector codificador dicta la secuencia para una sola cadena polipeptídica.



Fig. 11.13 - Estructura de la molécula de ARNm maduro eucariota


ARNm PROCARIOTA
1-Los ARNm procariotas presentan las secuencias codificadoras continuas, pues carecen de intrones.
2-No sufren modificaciones post-transcripcionales.
3-Muchos ARNm procariotas son policistrónicos, es decir que una sola molécula de ARNm contiene información para varias proteínas. Este ARNm contiene codones para la terminación y para la iniciación de la traducción entre las secciones codificadoras de proteínas, de modo que se traduce como varias moléculas de proteína distintas.



Fig. 11.14 - Estructura de la molécula de ARNm procariota


ARNt (TRANSFERENCIA)
Los ARNt son moléculas "adaptadoras" ya que interactúan por un lado con la cadena polinucleotídica (ARNm) y por el otro con los aminoácidos que formarán parte de la cadena polipeptídica, así alinean a los aminoácidos siguiendo el orden de los codones del ARNm.
Cada ARN t es una molécula de 70 a 93 ribonucléotidos. Enlaces puente hidrógeno entre sus bases repliegan la molécula dando origen a una disposición espacial en forma de trébol (Fig.11.15). Cada brazo presenta una zona de doble cadena y un asa o bucle de cadena simple sin apareamiento de bases. Interacciones posteriores doblan la estructura de trébol formando una "ele".
¿Por qué existen 64 codones y aproximadamente 31 ARNt, si en la naturaleza hay 20 aminoácidos ?
Existen 64 combinaciones posibles en que las 4 bases pueden ordenarse en tripletes o codones. De ellos, 3 son codones stop. Los 61 tipos restantes codifican para los 20 aminoácidos, existiendo para varios de ellos codones sinónimos (ver tabla 11.2).
Los anticodones de los ARNt reconocen a los codones del ARNm, sin embargo no hay 61 tipos distintos de ARNt porque no se requiere la complementaridad exacta entre los 3 nucleótidos del codón y el anticodón.
En muchos casos, mientras coincidan las 2 primeras bases del codón, hay suficiente "balanceo"en la tercera posición para permitir el acoplamiento con más de un tipo de nucleótido en el anticodón, de manera que existen aproximadamente 31 tipos de ARNt.
Por ejemplo el aminoácido fenilalanina es codificado por dos codones sinónimo: UUU / UUC. Sin embargo un solo anticodón AAG puede complementarse indistintamente con UUU y UUC, realizando el trabajo de llevar a la fenilalanina al ribosoma para ser incorporada a la cadena polipeptídica en formación .





Todos los ARNt presentan un porcentaje significativo de bases poco frecuentes que surgen por modificación post-transcripcional de los cuatro ribonucleótidos estándar A, G, C y U (Fig. 11.16).





Fig. 11.15 - Estructura del ARNt


Fig. 11.16 - Bases raras en el ARNt 

En esta molécula se distinguen básicamente dos extremos:
En el extremo 3' o extremo aceptor de la molécula se encuentra el trinucleótido CCA que representa el sitio de unión donde se liga el aminoácido. Esta unión es catalizada por una enzima aminoacil ARNt sintetasa específica y apropiada para cada uno de los 20 aminoácidos.
En el otro extremo de la "ele" se localiza un triplete de nucleótidos conocido como anticodón, cuya secuencia varía en cada tipo de ARNt. Cada anticodón es complementario de un codón del ARNm, aunque podría acoplarse a más de un codón (sinónimo).
Por lo hasta aquí expuesto, podemos concluir que el ARNt debe poseer varias propiedades específicas:
·   Debe ser reconocido por una aminoacil ARNt sintetasa que lo una al aminoácido correcto.
·   Debe tener una región que actúe como sitio de unión para el aminoácido.
·   Debe tener una secuencia complementaria (anticodón) específica para el codón del ARNm correcto.
Las modificaciones que sufren los pre-ARNt son semejantes en procariotas y en eucariotas en cuanto en ambos se producen escisiones y modificaciones químicas, por ejemplo se elimina un dinucleótido 3' del precursor y se agrega el triplete CCA a los ARNt que no poseen todavía esta secuencia terminal. También aparecen bases raras (Fig.11.16) por modificación enzimática de nucleótidos estándar del ARNt precursor.
Algunos genes para ARNt presentan un intrón que interrumpe la secuencia codificadora, él cual es removido post-transcripción. (Fig.11.17)



Fig. 11.17 - Intrón en el ARNt


ARNr (RIBOSÓMICO)
Los ARNr, junto a proteínas, son los componentes de los RIBOSOMAS. Los ribosomas y los ARNt intervienen en la traducción de la información codificada en el ARNm por lo cual los primeros son considerados fábricas de proteínas.
Cada ribosoma consta de dos subunidades: la subunidad MAYOR y la subunidad MENOR (Fig. 11.18)


Fig. 11.18 - Modelo tridimensional del ribosoma bacteriano visto desde distintos ángulos
La subunidad mayor contiene una depresión en una de sus superficies, en la cual se ajusta la subunidad menor. El ARNm se inserta en el surco formado entre las superficies de contacto de las subunidades. (Fig. 11.19).
Dentro de cada ribosoma hay dos huecos llamados sitios A (AMINOACÍDICO) y P (PEPTIDÍLICO), para el ingreso de los ARNt unidos a sus correspondientes aminoácidos. (Fig. 11.20)





Fig. 11.19- Modelo de ribosoma que representa la ubicación tentativa del ARNm y de la proteína naciente


Fig. 11.20- Sitios aminoacídico y peptidílico del ribosoma

Las subunidades ribosómicas trabajan conjuntamente para la síntesis proteica. La subunidad menor aloja al ARNm sobre el cual se acomodan los ARNt para que puedan unirse los aminoácidos que transportan.
La subunidad mayor cataliza la unión peptídica de los aminoácidos gracias a la acción de la peptidil transferasa ( enzima que forma parte de la estructura de esta subunidad). [1]
Si bien cumplen idéntica función, los ribosomas procariotas y eucariotas se diferencian en su tamaño, coeficiente de sedimentación [2] , y en el tipo y número de moléculas de ARNr y proteínas que los forman:


Fig. 11.21- Comparación de las estructuraas de los ribosomas procariotas y eucariotas
Todos los ARNr procariotas y eucariotas sufren modificaciones post-transcripción.
En eucariotas los ARNr 18S; 5,8S y 28S son transcriptos de un mismo gen que codifica para un pre-ARNr 45S. La síntesis del este transcripto primario se realiza en la zona fibrilar del nucléolo a partir de la ARN pol I. Una vez obtenido el largo transcripto primario, se eliminan las secuencias espaciadoras(tramos de ARN inútiles para integrar la estructura ribosómica), las que serán degradadas por enzimas. Las secuencias resultantes utilizables de ARNr (28S, 18S y 5,8S) son metiladas y junto con ARNr 5S extranucleolar, se ensamblan a proteínas importadas del citoplasma para conformar la subunidades ribosómicas (Fig. 11.22).




Fig. 11.22 - Procesamiento de los ARN 45S 
Las subunidades ribosómicas en distintos estadios de ensamblaje, se localizan en la periferia del nucléolo, conformando la zona granular del mismo.
Finalmente, las subunidades ribosómicas por separado y antes de completar sus respectivos ensambles, son exportadas al citoplasma a través del complejo del poro, concluyendo el procesamiento de cada subunidad en el citosol.
Respecto del ARNr 5S no transcripto en el nucléolo, una vez sintetizado se incorpora al resto de los componentes para conformar la subunidad mayor del ribosoma (Fig.11.23).







Fig. 11.23 - Ensamblaje de subunidades ribosómicas
LOS ARN PEQUEÑOS
Los ARN pequeños forman complejos con proteínas específicas dando lugar a la formación de partículas ribonucleoproteicas (RNP).
Las RNP localizadas en el núcleo se denominan RNPpn: partícula ribonucleoproteica pequeña ( sn RNP/s: small -pequeña- /n: nuclear-RNP:ribonucleoproteica). Varios RNPpn conocidos como U1 a U6 participan en el procesamiento de los ARNm. Estas partículas forman un complejo multienzimático denominado espliceosoma, encargado de realizar cortes y empalmes en los ARNm transcritos primarios (splicing) .
Las RNP localizadas en citoplasma se denominan RNPpc: partícula ribonucleoproteica pequeña citoplasmática (scRNP/s: small/ c:cytosolic-citosol-/RNP:ribonucleoproteica). La función más conocida de cualquier RNPpc es la que desempeña el complejo ARN /proteínas que componen la partícula dereconocimiento de la señal o SRP. Estas partículas participan en el reconocimiento de secuencias específicas de las proteínas de secreción, membranares y lisosomales, deteniendo su traducción hasta que el ribosoma en donde se están sintetizando se contacte con la membrana del retículo endoplasmático granular, en donde finalizan su traducción.



 bibliografia:

www.genomasur.com/lecturas/Guia11.htm







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