Cuando se agrega ADN a poblaciones de células eucariontes en cultivo, entra a las células y, en algunas de ellas resulta la producción de nuevas proteínas. Este proceso puede hacerse rutinariamente con ADN purificado cuya incorporación lleva a la producción de una proteína particular:
Las células que carecen del gen TK no pueden producir timidina cinasa y mueren en ausencia de timidina:
Agregando ADN TK+
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Algunas células poseen el gen TK
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Células carentes del
gen TK (TK-) colonias de células TK+
Células muertas células vivas
Figura: representación del experimento de transfección.
Históricamente, estos experimentos, se denominan transfección cuando se llevan a cabo con células eucariontes, son la contraparte directa de la transformación bacteriana.
Con estos experimentos, se demuestra que el ADN es el material genético de los eucariontes y que puede ser transferido entre diferentes especies y continuar funcional.
La transfección consiste en la introducción de material genético externo en células eucariotas mediante plásmidos, vectores víricos (en este caso también se habla de transducción) u otras herramientas para la
transferencia. El término transfección
para métodos no viralesse usa en referencia a células de mamífero,
mientras que el término transformación se prefiere para describir las
transferencias no virales de material genético en bacterias y células eucariotas no animales como hongos, algas o plantas.
La transfección de células animales
generalmente se lleva a cabo abriendo poros o "agujeros" transitorios
en la membrana plasmática de las células mediante electroporación,
para permitir el paso del material genético (como construcciones de DNA superenrollado o siRNA) aunque pueden ser
transfectadas incluso proteínas (como anticuerpos,
por ejemplo). Además de la electroporación, se pueden utilizar otras técnicas
para efectuar la transfección, como por ejemplo liposomas producidos mediante la mezcla de lípidos catiónicos con el material genético, que se
fusionarán con la membrana plasmática celular y depositarán su carga adentro.
El significado original de
"transfección" era "infección por transformación", es
decir, introducción de DNA o RNA desde un virus procariótico ó bacteriófago en las células, resultando en una infección.
Al tener el término transformación otro sentido en biología celularanimal (un cambio genético que
permite la propagación durante largos periodos de células en cultivo,
o la adquisición de propiedades típicas de las células cancerígenas), el
término transfección adquirió, para células animales, su actual signifiado de
cambio en las propiedades celulares por la introducción de material genético.
Técnicas
de transfección
Las técnicas de
transfección son la imagen de las técnicas de transformación en procariotas, se
basan en la inserción de material exógeno en el genoma de ese organismo.
Podemos considerar dos grandes grupos de técnicas de transfección, los llamados métodos físicos (se basan en el uso de sistemas mecánicos, no biológicos, para lograr la inserción de material genético en las células) y los métodos químicos.
Podemos considerar dos grandes grupos de técnicas de transfección, los llamados métodos físicos (se basan en el uso de sistemas mecánicos, no biológicos, para lograr la inserción de material genético en las células) y los métodos químicos.
Las diferencias entre
métodos químicos y físicos se encuentran a nivel metodológico, no a nivel de
resultados, ya que el conjunto de métodos físicos no se basa en ningún sistema
biológico, sino que pretende una inserción a “la fuerza”, de ese material
genético. También hay que decir que este conjunto de técnicas sólo es funcional
in vitro, ya que es necesaria la exposición de las células a medios extremos.
Podemos clasificar
estos métodos en:
Métodos químicos
DNA desnudo
Liposomas
Métodos físicos
Electroporación
Microinyección
Métodos químicos
DNA desnudo
Liposomas
Métodos físicos
Electroporación
Microinyección
TRANSFECCIÓN
Las técnicas de transfección
celular, que se han desarrollado fundamentalmente para permitir la introducción
de ácidos nucleicos en el interior de las células, han permitido en gran medida
ampliar los conocimientos acerca de la regulación génica y de la función de las
proteínas en los sistemas celulares. Actualmente se emplean en gran número de
aproximaciones experimentales, en la generación de animales transgénicos, en la
selección de líneas celulares modificadas, etc...
La introducción de una construcción de DNA
recombinante en la que se ha situado el CDS (secuencia codificante) de un
gen reportero (luciferasa, 'green
fluorescent protein', beta-galactosidasa,
cloramfenicol acetiltransferasa -CAT-, etc..) bajo una secuencia de
regulación que se desea estudiar permite medir con facilidad tasas de expresión
génica en diferentes situaciones experimentales.
Por el contrario, la
introducción de un plásmido que contienen la secuencia codificante (CDS) de una
proteína de interés bajo el control de un promotor (constitutivo, regulado,
etc...) permite la producción de la proteína deseada que puede estar o no etiquetada
('tagged). En este caso se emplea la célula como una factoría de síntesis de
proteínas a la que se le introduce
en forma de
plásmido la información de la
proteína que se desea sintetice.
Tanto en el primero como en
el segundo caso puede ser importante seleccionar las células que han adquirido
el plásmido. Para facilitarlo se incluyen en éstos genes de resistencia a
drogas que permiten a las células que los han adquirido sobrevivir en medios
selectivos. Uno de los sistemas de selección más empleado es el de la resistencia
a G418 (resistencia a neomicina) que permite seleccionar clones celulares de
expresión estable. Así diferenciaremos entre la transfección temporal o transiente
y la transfección estable o de larga duración.
9.2 Mecanismos de transferencia artificial:
Las técnicas de transfección actuales se pueden
clasificar en:
MÉTODOS FÍSICOS.
Basados en la introducción
mecánica de las moléculas en el interior de la célula.
MICROINYECCIÓN DIRECTA.
ƒ Es una técnica muy
efectiva aunque laboriosa. Es el método que se emplea en la introducción del
DNA recombinante en las células embrionarias en el proceso de obtención de
animales transgénicos.
ELECTROPORACIÓN.
ƒ 'biolistic particle
delivery'. Introducción del DNA adherido a micropartículas que se disparan
sobre las células.
Una vez introducida la
molécula de DNA recombinante en el interior de las células producirá su efecto
permitiendo, por ejemplo :
Seleccionar células que hayan incorporado el
DNA. Este sería el caso del aislamiento de clones celulares que presentaran
expresión de un determinado producto. Es posible por la incorporación en el
propio vector de marcadores de selección, típicamente la resistencia de G418
(neomicina), ...
A las pocas horas o días detectar la presencia
de la proteína codificada por el plásmido.
MÉTODOS QUÍMICOS.
Basados en la formación de
complejos que las células sean capaces de adquirir e incorporar, bien sea
directamente mediante la ruta endocítica (fosfato cálcico, DEAE dextrano) o a
las membranas (lipofección).
MÉTODO DEL FOSFATO CÁLCICO.
Basado en la obtención de un
precipitado entre el cloruro de calcio y el DNA en una solución salina de fosfatos.
MÉTODO DEL DEAE DEXTRANO.
Basado en la obtención de
complejos entre la resina DEAE y el DNA. Los polímeros de DEAE dextrano o polybreno tienen una carga que les permite
unirse a las muy negativamente cargadas moléculas de DNA. El DNA acomplejado se
introduce en las células mediante choque osmótico mediante DMSO o glicerol. El
uso de DEAE dextrano se limita a las transfecciones transientes.
Los problemas que encontramos son que el DNA (rico en cargas -) por ser estructura polar tiene muchas dificultades para cruzar la membrana plasmática. Además el DNA codificante para 1 gen es aproximadamente de 10 kb, esto representa la longitud aproximada de una célula, en el caso de encontrar el DNA sin ningun tipo de compactatción.
Método Péptidos fusiogénicos Los péptidos fusiogénicos surgen en una linea de trabajo que nos permita paliar aquellas características del DNA desnudo que nos impiden la entrada.
Estos péptidos fusiogénicosa se utilizan para compactar DNA. y de este modo adoptan DNA con proteínas ricas en cargas +, del tipos Histonas. Esto supone una condensación considerable, (visible con MET) ya que el DNA aparece en la forma de partículas de 50-150 nanometros, pero sólo un cierto grado de condensación permite que 1 transportador incluya 1 molécula de DNA. Asimismo la reducción de tamaño del DNA hasta unos 20 nanometros facilitaría el paso a la célula y hasta el núcleo, incrementando su protección contra las nucleases citoplasmáticas. En el proceso de penetración celular, los transportadores sintéticos (si su carga neta es +) interactuan con Aminoazucares de la Membrana plasmáticacon (carga -) para producir la incorporación a la célula en forma de endosomas. Por tanto tenemos un problema más a superar.
También se ha visto que los puntos en dónde se da una mayor transferencia son los pulmones y el hígado, con lo que se considera que los transportadores se agrupan en grandes complejos y que interactuan con proteínas de la sangre, con lo que no abandonan eficazmente el sistema vascular, finalmente son retenidos por los filtros naturales del cuerpo, tales como los pulmones o el hígado, en dónde interactuan.
Esto marca dos puntos a superar en este modelo de transferencia de genes in vivo, en primer lugar el superar los filtros naturales que presenta todo organismo, en segundo punto dirigir el transportador dentro del cuerpo con tal de incrementar la afinidad a las células diana.
Una solución propuesta a este último problema es unirlos a ligandos específicos, tales como azúcares, aminoacidos, hormonas,.... Una vez en el tejido adecuado, el proceso de absorción se da por endocitosis formandose un endosoma (en este punto el transportador con el vector han de salir al citoplasma, ya que si no recibirán ataques lisosomales que digerirán el conjunto). Para conseguir una salida se acopla al vector un péptido fusiogena (p.ej. una molécula DOPE, que permite la salida del endosoma por desestabilitzación de les Mbs).
Des del citoplasma, ahora se tiene que dar la entrada al núcleo, este proceso queda detenido por la envoltura nuclear, con la que el vector sólo puede entrar al núcleo en división, cuando se desorganiza la envoltura nuclear. La envoltura sólo deja pasar por difusión moléculas inferiores a los 9 nanómetros, aunque mediante los transportadores de reconocimiento de la Señal de localización nuclear, podrian entrar moléculas de entre 9-25 nm (los transportadores sintéticos actuales miden más de 25 nm). Lo que nos implica otra nueva dificultad.
MÉTODO DE LIPOFECCIÓN.
Se basa en la foamción de
complejos entre lípidos catiónicos y DNA. El complejo tiene afinidad por la membrana
y permite la entrada del DNA en el citosol. Una de las posibles vías es la
incorporación de liposomas a la membrana y la entrada flip-flap. Existen un
gran número de lípidos que se emplean en lipofección, aunque existe una estructura
consenso de un lípido catiónico sintético, a partir de la cual se han diseñado
muchas variantes (por ej. DOPE). Es esencial optimizar las condiciones
específicas de transfección para obtener buenas eficiencias, que suelen ser en buenas
condiciones de entre el 70 y el 90% de las células de la placa. Las desventajas
del método es, aparte del elevado precio de los lípidos, el hecho de que no
todos los lípidos funcionan en todos los tipos celulares, y que hay que
optimizar el ensayo para cada tipo celular. Los parámetros a optimizar son la relación
entre lípido y DNA (relación de cargas), la cantidad de DNA empleado, el tiempo
que se exponen las células al complejo y la presencia o ausencia de suero. Tienes una buena revisión en la página de la
Universidad Vanderbilt dedicada a los lípidos catiónicos.
BIBLIOGRAFIA
http://www.cultek.com/inf/otros/Notas_tecnicas/transfeccion.pdf
http://biologia.uab.es/genetica/curso/EnsayosAlumnos/Christian-Rene/tectrans.html
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