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lunes, 4 de junio de 2012

9.1.5 Transfección.


Transfección


Cuando se agrega ADN a poblaciones de células eucariontes en cultivo, entra a las células y, en algunas de ellas resulta la producción de nuevas proteínas. Este proceso puede hacerse rutinariamente con ADN purificado cuya incorporación lleva a la producción de una proteína particular:

Las células que carecen del gen TK no pueden producir timidina cinasa y mueren en ausencia de timidina:


Agregando ADN TK+

 

Algunas células poseen el gen TK
 







Células carentes del
gen TK (TK-)                                                 colonias de células TK+


       Células muertas       células vivas

Figura: representación del experimento de transfección.

Históricamente, estos experimentos, se denominan transfección cuando se llevan a cabo con células eucariontes, son la contraparte directa de la transformación bacteriana.

Con estos experimentos, se demuestra que el ADN es el material genético de los eucariontes y que puede ser transferido entre diferentes especies y continuar funcional.




La transfección consiste en la introducción de material genético externo en células eucariotas mediante plásmidos, vectores víricos (en este caso también se habla de transducción) u otras herramientas para la transferencia. El término transfección para métodos no viralesse usa en referencia a células de mamífero, mientras que el término transformación se prefiere para describir las transferencias no virales de material genético en bacterias y células eucariotas no animales como hongos, algas o plantas.
La transfección de células animales generalmente se lleva a cabo abriendo poros o "agujeros" transitorios en la membrana plasmática de las células mediante electroporación, para permitir el paso del material genético (como construcciones de DNA superenrollado o siRNA) aunque pueden ser transfectadas incluso proteínas (como anticuerpos, por ejemplo). Además de la electroporación, se pueden utilizar otras técnicas para efectuar la transfección, como por ejemplo liposomas producidos mediante la mezcla de lípidos catiónicos con el material genético, que se fusionarán con la membrana plasmática celular y depositarán su carga adentro.
El significado original de "transfección" era "infección por transformación", es decir, introducción de DNA o RNA desde un virus procariótico ó bacteriófago en las células, resultando en una infección. Al tener el término transformación otro sentido en biología celularanimal (un cambio genético que permite la propagación durante largos periodos de células en cultivo, o la adquisición de propiedades típicas de las células cancerígenas), el término transfección adquirió, para células animales, su actual signifiado de cambio en las propiedades celulares por la introducción de material genético.

Técnicas de transfección

  Las técnicas de transfección son la imagen de las técnicas de transformación en procariotas, se basan en la inserción de material exógeno en el genoma de ese organismo.
  Podemos considerar dos grandes grupos de técnicas de transfección, los llamados métodos físicos (se basan en el uso de sistemas mecánicos, no biológicos, para lograr la inserción de material genético en las células) y los métodos químicos.
Las diferencias entre métodos químicos y físicos se encuentran a nivel metodológico, no a nivel de resultados, ya que el conjunto de métodos físicos no se basa en ningún sistema biológico, sino que pretende una inserción a “la fuerza”, de ese material genético. También hay que decir que este conjunto de técnicas sólo es funcional in vitro, ya que es necesaria la exposición de las células a medios extremos.
 Podemos clasificar estos métodos en:
Métodos químicos
                    
DNA desnudo
                    
Liposomas
Métodos físicos
                    
Electroporación
                    
Microinyección




TRANSFECCIÓN

Las técnicas de transfección celular, que se han desarrollado fundamentalmente para permitir la introducción de ácidos nucleicos en el interior de las células, han permitido en gran medida ampliar los conocimientos acerca de la regulación génica y de la función de las proteínas en los sistemas celulares. Actualmente se emplean en gran número de aproximaciones experimentales, en la generación de animales transgénicos, en la selección de líneas celulares modificadas, etc...
 La introducción de una construcción de DNA recombinante en la que se ha situado el CDS (secuencia codificante) de un gen  reportero (luciferasa, 'green fluorescent protein', beta-galactosidasa,  cloramfenicol acetiltransferasa -CAT-, etc..) bajo una secuencia de regulación que se desea estudiar permite medir con facilidad tasas de expresión génica en diferentes situaciones experimentales.
Por el contrario, la introducción de un plásmido que contienen la secuencia codificante (CDS) de una proteína de interés bajo el control de un promotor (constitutivo, regulado, etc...) permite la producción de la proteína deseada que puede estar o no etiquetada ('tagged). En este caso se emplea la célula como una factoría de síntesis de proteínas a la que se  le  introduce  en  forma  de  plásmido  la información de la proteína que se desea sintetice.
Tanto en el primero como en el segundo caso puede ser importante seleccionar las células que han adquirido el plásmido. Para facilitarlo se incluyen en éstos genes de resistencia a drogas que permiten a las células que los han adquirido sobrevivir en medios selectivos. Uno de los sistemas de selección más empleado es el de la resistencia a G418 (resistencia a neomicina) que permite seleccionar clones celulares de expresión estable. Así diferenciaremos entre la transfección temporal o transiente y la transfección estable o de larga duración.

9.2 Mecanismos de transferencia artificial: 

Las técnicas de transfección actuales se pueden clasificar en:

MÉTODOS FÍSICOS. 

Basados en la introducción mecánica de las moléculas en el interior de la célula.
  
 MICROINYECCIÓN DIRECTA.

ƒ Es una técnica muy efectiva aunque laboriosa. Es el método que se emplea en la introducción del DNA recombinante en las células embrionarias en el proceso de obtención de animales transgénicos.
 
 ELECTROPORACIÓN.
 
ƒ 'biolistic particle delivery'. Introducción del DNA adherido a micropartículas que se disparan sobre las células. 
Una vez introducida la molécula de DNA recombinante en el interior de las células producirá su efecto permitiendo, por ejemplo :
 Seleccionar células que hayan incorporado el DNA. Este sería el caso del aislamiento de clones celulares que presentaran expresión de un determinado producto. Es posible por la incorporación en el propio vector de marcadores de selección, típicamente la resistencia de G418 (neomicina), ...
 A las pocas horas o días detectar la presencia de la proteína codificada por el plásmido. 

MÉTODOS QUÍMICOS.
 
Basados en la formación de complejos que las células sean capaces de adquirir e incorporar, bien sea directamente mediante la ruta endocítica (fosfato cálcico, DEAE dextrano) o a las membranas (lipofección). 
 
MÉTODO DEL FOSFATO CÁLCICO.

Basado en la obtención de un precipitado entre el cloruro de calcio y el DNA en una solución salina de  fosfatos.
 MÉTODO DEL DEAE DEXTRANO.
 
Basado en la obtención de complejos entre la resina DEAE y el DNA. Los polímeros de DEAE dextrano  o polybreno tienen una carga que les permite unirse a las muy negativamente cargadas moléculas de DNA. El DNA acomplejado se introduce en las células mediante choque osmótico mediante DMSO o glicerol. El uso de DEAE dextrano se limita a las transfecciones transientes.

Método DNA desnudo. El DNA desnudo (técnica en fase altamente experiemtal) es incapaz de entrar en una célula y aún consiguiendo entrar en ellas es rápidamente degradado. La línea de investigación busca incorporar esas secuencias de DNA a un transportador, que le encierra y le lleva hasta la célula Diana en dónde a través de interacciones de membrana se asocia con ella para entregar el material al interior.
  Los problemas que encontramos son que el DNA (rico en cargas -) por ser estructura polar  tiene muchas dificultades para cruzar la membrana plasmática. Además el DNA codificante para  1 gen es aproximadamente de 10 kb, esto representa la longitud aproximada de una célula, en el caso de encontrar el DNA sin ningun tipo de compactatción.


            Método Péptidos fusiogénicos Los  péptidos fusiogénicos surgen en una linea de trabajo que nos permita paliar aquellas características del DNA desnudo que nos impiden la entrada.
 Estos péptidos fusiogénicosa se utilizan para compactar DNA. y de este modo adoptan DNA con proteínas ricas en cargas +, del tipos Histonas. Esto supone una condensación considerable, (visible con MET) ya que el DNA aparece en la forma de partículas de 50-150 nanometros, pero sólo un cierto grado de condensación permite que 1 transportador incluya 1 molécula de DNA. Asimismo la reducción de tamaño del DNA hasta unos 20 nanometros facilitaría el paso a la célula y hasta el núcleo, incrementando su protección contra las nucleases citoplasmáticas. En el proceso de penetración celular, los transportadores sintéticos (si su carga neta es +) interactuan con Aminoazucares de la Membrana plasmáticacon (carga -) para producir la incorporación a la célula en forma de endosomas. Por tanto tenemos un problema más a superar.
También se ha visto que los puntos en dónde se da una mayor transferencia son los pulmones y el hígado, con lo que se considera que los transportadores se agrupan en grandes complejos y que interactuan con proteínas de la sangre, con lo que no abandonan eficazmente el sistema vascular, finalmente son retenidos por los filtros naturales del cuerpo, tales como los pulmones o el hígado, en dónde interactuan.
Esto marca dos puntos a superar en este modelo de transferencia de genes in vivo, en primer lugar el superar los filtros naturales que presenta todo organismo, en segundo punto dirigir el transportador dentro del cuerpo con tal de incrementar la afinidad a las células diana.
Una solución propuesta a este último problema es unirlos a ligandos específicos, tales como azúcares, aminoacidos, hormonas,.... Una vez en el tejido adecuado, el proceso de absorción se da por endocitosis formandose un endosoma (en este punto el transportador con el vector han de salir al citoplasma, ya que si no recibirán ataques lisosomales que digerirán el conjunto). Para conseguir una salida se acopla al vector un péptido fusiogena (p.ej. una molécula DOPE, que permite la salida del endosoma por desestabilitzación de les Mbs).
Des del citoplasma, ahora se tiene que dar la entrada al núcleo, este proceso queda detenido por la envoltura nuclear, con la que el vector sólo puede entrar al núcleo en división, cuando se desorganiza la envoltura nuclear. La envoltura sólo deja pasar por difusión moléculas inferiores a los 9 nanómetros, aunque mediante los transportadores de reconocimiento de la Señal de localización nuclear, podrian entrar moléculas de entre 9-25 nm (los transportadores sintéticos actuales miden más de 25 nm). Lo que nos implica otra nueva dificultad.



MÉTODO DE LIPOFECCIÓN.
 
Se basa en la foamción de complejos entre lípidos catiónicos y DNA. El complejo tiene afinidad por la membrana y permite la entrada del DNA en el citosol. Una de las posibles vías es la incorporación de liposomas a la membrana y la entrada flip-flap. Existen un gran número de lípidos que se emplean en lipofección, aunque existe una estructura consenso de un lípido catiónico sintético, a partir de la cual se han diseñado muchas variantes (por ej. DOPE). Es esencial optimizar las condiciones específicas de transfección para obtener buenas eficiencias, que suelen ser en buenas condiciones de entre el 70 y el 90% de las células de la placa. Las desventajas del método es, aparte del elevado precio de los lípidos, el hecho de que no todos los lípidos funcionan en todos los tipos celulares, y que hay que optimizar el ensayo para cada tipo celular. Los parámetros a optimizar son la relación entre lípido y DNA (relación de cargas), la cantidad de DNA empleado, el tiempo que se exponen las células al complejo y la presencia o ausencia de suero.  Tienes una buena revisión en la página de la Universidad Vanderbilt dedicada a los lípidos catiónicos.  

BIBLIOGRAFIA

http://www.cultek.com/inf/otros/Notas_tecnicas/transfeccion.pdf
http://biologia.uab.es/genetica/curso/EnsayosAlumnos/Christian-Rene/tectrans.html
 http://laguna.fmedic.unam.mx/~evazquez/0403/dna%20material%20genetico1.html

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