TAREA UNIDAD 9

INSTITUTO TECNOLOGICO DE CD. ALTAMIRANO GRO

LIC: BIOLOGIA

MATERIA:

BIOLOGÍA MOLECULAR

UNIDAD NUMERO 9

"TAREA"

NOMBRE DEL ALUMNO:

LUIS ÁNGEL DAMASO ALVARADO

SEMESTRE Y GRUPO:

Vl SEMESTRE “A”

NOMBRE DEL PROFESOR:

FRANCISCO JAVIER PUCHE ACOSTA

CD.ALTAMIRANO, GRO     JUNIO/2012 

¿LAS BACTERIAS DE DIFERENTES ESPECIES PUEDEN COMPARTIR PLASMIDOS? 

(TRANSFORMACIÓN)

Si, las bacterias pueden compartir plásmidos de diferentes especies mediante un mecanismo de transformación, un proceso en el que las bacterias pueden tomar DNA exógeno del medio circundante, las bacterias en este proceso dependen del medio. Cualquier tipo que sea el plásmido dependiendo del ambiente que se presente, las bacterias tomaran el DNA tomando solo una pequeña parte de él aproximadamente segmentos de 4-5 kb de 200 kb presentes en el medio. Después las bacterias se transforman pasando a ser recombinadas. 

Las bacterias se transforman, se adaptan, se hacen más fuertes y resistentes a antibióticos.

La transformación genética de bacterias  es un procedimiento de laboratorio por el cual se introduce material genético a una bacteria. Existen otros procesos de inserción del material genético, que dependiendo del organismo receptor y el mecanismo, algunos reciben nombres como transfección  o transducción . Generalmente, el material genético insertado es conocido como plásmido  (DNA circular), pero pueden insertarse otras formas de material genético, como DNA o RNA. Los plásmidos  utilizados para la transformación de bacterias contienen en general, uno o varios genes de interés, un gen reportero (que permite visualizar la transcripción del plásmido), y un gen de resistencia a un antibiótico, que permite seleccionar a la bacteria transformada de otras, por su capacidad de crecer en medio que contiene el antibiótico de resistencia.
La transformación tiene muchas aplicaciones, como la producción de proteínas, la producción de los mismos plásmidos, la producción de bacterias que consumen petróleo , entre otros. Sin embargo, deben manejarse de forma especial, tanto en el laboratorio, como el manejo de desechos, para evitar la diseminación o liberación al ambiente de microorganismos genéticamente modificados.

plasmido 

TRANSFORMACIÓN BACTERIANA

Los principios de la herencia de Gregor Mendel siguieron siendo ampliamente aceptados durantemucho tiempo pero aun se desconocía la naturaleza del material hereditario. Los científicos sabíanque los genes se encontraban en los cromosomas y que los cromosomas consistían de ADN y queestos a su vez formaban a las proteínas. Sin embargo las proteínas parecían ser la mejor opciónpara ser la candidata a ser el material genético, debido a que los análisis genéticos mostraban quelas proteínas tenían más variabilidad que el ADN en su composición química, así como en suspropiedades físicas.A raíz de la epidemia mortífera de la gripe de 1918, los gobiernos de todo el mundo seapresuraron a desarrollar vacunas que pudiesen detener la propagación de enfermedadesinfecciosas. En Inglaterra el microbiólogo Frederick Griffith realzo el estudio de dos cepas de

Streptococcus pneumoniae

que variaban drásticamente tanto en su apariencia y su virulencia; enconcreto la cepa virulenta (S) de aspecto liso contenía una capsula lisa o capa externa compuestade polisacáridos, mientras que la cepa no virulenta (R) tenía un aspecto áspero y carecía decapsula. Los ratones inyectados con la cepa S morían mientras que los inyectados con la cepa Rvivían. A través de una serie de experimentos, Griffith estableció que la virulencia de la cepa S eradestruida por el calentamiento de la bacteria; así, se sorprendió al encontrar que los ratonesmurieron cuando fueron inyectados con una mezcla de la cepa S(muertas por calor) con las de lacepa R, suceso que no paso cuando se inyectaban solas. Griffith fue capaz de aislar bacterias vivasdel corazón de los ratones muertos que habían sido inyectados por la cepa mixta; y se observo queestas bacterias no tenían las características de la bacteria S. Basándose en estas observacionesGriffith, planteo la hipótesis de que

un componente químico de las células S virulentas de algunamanera habían transformado las células R en la forma virulenta S.

La transformación en genética se refiere a la alteración genética de una célula que resulta de laintroducción y expresión de material genético externo (DNA). En bacterias, la transformaciónrefiere a un cambio genético estable producido al incorporar ADN desnudo (ADN sin células oproteínas asociadas), y la competencia refiere al estado de ser capaz de incorporara ADN exógenodel ambiente (alterando a su fenotipo y el de sus descendientes). El DNA exógeno pasará a ladescendencia sólo si este se integra en el material genético de la célula blanco o si el mismo tieneun origen de replicación (

ori 

), que funcione en la célula blanco.Tras la transformación, la célula que ha recibido el ADN se suele denominarse transformante.Dos formas distintas de competencia deben ser distinguidas: natural y artificial.

TRANSFORMACIÓN NATURAL

C

aracteres generales de la transformación natural:1. El ADN, para que sea capaz de transformar, ha de ser de cadena doble.2. Para cada evento de transformación basta la interacción de una sola molécula de ADN con lacélula receptora; el número de moléculas de ADN que puede tomar una misma célula es limitado,y presenta una cinética de saturación.3. No todas las células de un mismo cultivo son transformables en cualquier momento del ciclo decrecimiento.4. Se denomina fase de eclipse durante la transformación al período transitorio durante el cual, sise extrae el ADN recién entrado (exogenote), este ADN es incapaz de volver a transformar.En la transformación natural de diversas especies bacterianas se dan una serie de fases comunes atodas ellas, aunque en cada caso existen rasgos propios:

1. Competencia:

condicionado por una serie de factores, como densidad celular, temperatura, pH,etc. En Gram positivas es por la síntesis y excreción de

C

SP (iníciales de péptido estimulador de lacompetencia; en Gram negativas el estado de competencia no depende de señal activadorasegregada al medio, sino que se induce internamente.

EJEMPLOS

Los mamíferos somos incapaces de vivir con una dieta compuesta exclusivamente por plantas, simplemente no tenemos las enzimas necesarias para poder romper y degradar las fibras vegetales para poder asimilarlas. Sin embargo, existen muchos animales que si pueden hacerlo, los más conocidos son los rumiantes.

Estos animales tienen un sistema digestivo compuesto de cuatro compartimientos: el rumen, el retículo, el omaso y el abomaso. Los dos primeros forman una única cavidad llamada retículo-rumen y es donde habitan un gran número de bacterias —de 10 mil a 100 mil millones por cada mililitro— que le dan a los rumiantes la habilidad de convertir la indigerible materia vegetal en productos asimilables.

Pero donde hay bacterias es muy probable que también hayan plásmidos —unas pequeñas secuencias de ADN con la capacidad de autoreplicarse. Los plásmidos también cargan información relevante, por ejemplo: genes de virulencia, genes de resistencia a antibióticos, genes que codifican enzimas para degradar moléculas complejas, etc. Y por si fuera poco, los plásmidos pueden introducirse en cualquier bacteria, sin importar la especie de la cual proceden. Esto es una ventaja evolutiva para las bacterias porque pueden intercambiar material genético entre especies completamente diferentes en un proceso conocido como Transferencia Horizontal de Genes (THG).

Los plásmidos han sido encontrados en gran abundancia en hábitats donde hay una gran cantidad de comunidades bacterianas diferentes, por ejemplo: en nuestro tracto digestivo. Si tan sólo nos imagináramos como es este caótico lugar no sería tan diferente a un mercado negro de armas del medio oriente, donde las bacterias intercambian genes a diestra y siniestra unos con otros sin control alguno.

En vista que los plásmidos cargan genes con funciones accesorias, podrían contribuir con la diversidad fenotípica del hospedero, o sea, favorecerlo para que pueda realizar funciones que normalmente no podría realizar, por ejemplo: la de degradar el material vegetal de la dieta. Pero Entonces ¿será que las funciones accesorias de los plásmidos presentes en un determinado hábitat depende del nicho ecológico?

Un grupo de investigadores israelíes sugiere que sí porque al analizar y caracterizar la población total de plásmidos del rumen bovino observaron que estos codificaban enzimas importantes para realizar funciones que se encuentran enriquecidas en este ambiente, como aquellas que permiten el transporte de azúcares a través de las paredes celulares de las bacterias. El estudio fue publicado el 19 de Marzo en PNAS.

Lo primero que hicieron el Dr. Itzhak Mizrahi, autor principal del estudio, y sus colegas fue colectar medio litro del contenido del rumen de 16 vacas, una hora después de haber sido alimentadas. Luego sometieron las muestras a un tratamiento con una enzima que degrada sólo el ADN cromosómico quedando los plásmidos libres para ser secuenciados. Finalmente compararon las secuencias del “plasmidoma” (nombre que hace referencia a todos los plásmidos hallados en el rumen) con las bases de datos de plásmidos para determinar su origen.

La mayor parte de las 34 millones de secuencias de plásmidos obtenidos del rumen eran de origen bacteriano: Firmicutes (47%), Bacteroidetes (22%) y Proteobacteria (20%). Sin embargo, estos valores no coincidían precisamente con las proporciones de bacterias halladas en las mismas muestras: Firmicutes (44%), Bacteroidetes (50%) y Proteobacteria (5%). La explicación podría ser que las Proteobacterias cargan más plásmidos que los Bacteroidetes o que los plásmidos de este último grupo están poco representados en las bases de datos.

Por otro lado, muchas de las secuencias del plasmidoma coincidieron perfectamente con las secuencias de plásmidos aislados anteriormente de otros rumiantes, lo que indicaría que no sólo las bacterias que comparten un mismo nicho ecológico son similares, sino también los plásmidos. Además, las funciones que codifican estos plásmidos se encuentran enriquecidas en el rumen bovino, por ejemplo: enzimas para transportar los azúcares complejos generados por la degradación de la fibra vegetal, síntesis de cofactores y vitaminas, metabolismo de proteínas y aminoácidos, entre otras.

Toda esta gama de genes disponibles libremente le permiten a las bacterias del rumen evolucionar y adaptarse a este nicho ecológico, favoreciendo al animal hospedero quien se beneficiará de un mejor aprovechamiento de los nutrientes presentes en la materia vegetal.

BIBLIOGRAFIA

http://www.biounalm.com/2012/03/plasmidos-en-el-rumen-bovino-favorecen.html

http://seguridadbiologica.blogspot.mx/2011/02/transformacion-bacteriana.html

http://es.scribd.com/doc/29798290/TRANSFORMACION-BACTERIANA-TODO

COCLUSIONES

Las conclusiones de la unidad número 9 que es la transferencia del material genético, son las siguientes primeramente se cumplió el objetivo planteado al inicio de la unidad, se aprendió las estrategias que utilizan las bacterias para transferir o intercambiar el DNA unas otras por diferentes procesos, solo en el proceso de transformación las bacterias toman el DNA del medio circundante, otras transfieren material genético por conjugación, recombinación en los virus y transducción mediante fagos. Estas son las estrategias que utilizan las bacterias para la transferencia del material genético, y ahora las estrategias que utilizan en los eucariotas se da de matera artificial en el cual introducen DNA por métodos físicos o químicos en las células eucariotas, en los métodos físicos tenemos micro inyección en animales, electroporacion para bacterias y pistola de genes para plantas, y los métodos químicos se encuentran el Método del fosfato cálcico, Método del DEAE dextrano, Método DNA desnudo, Método Péptidos fusiogénicos y el Método  de Liposomas. Como vemos son muy diferentes los métodos que utilizan las bacterias a comparación con los eucariotas, en concreto se analizo las diferencias que existen entre las células eucariotas y las células procariotas en el proceso de transferencia del material genético.

9.1.5 Transfección.

Cuando se agrega ADN a poblaciones de células eucariontes en cultivo, entra a las células y, en algunas de ellas resulta la producción de nuevas proteínas. Este proceso puede hacerse rutinariamente con ADN purificado cuya incorporación lleva a la producción de una proteína particular:

Las células que carecen del gen TK no pueden producir timidina cinasa y mueren en ausencia de timidina:

Agregando ADN TK+

 

Algunas células poseen el gen TK

 

Células carentes del

gen TK (TK-)                                                 colonias de células TK+

       Células muertas       células vivas

Figura: representación del experimento de transfección.

Históricamente, estos experimentos, se denominan transfección cuando se llevan a cabo con células eucariontes, son la contraparte directa de la transformación bacteriana.

Con estos experimentos, se demuestra que el ADN es el material genético de los eucariontes y que puede ser transferido entre diferentes especies y continuar funcional.

La transfección consiste en la introducción de material genético externo en células eucariotas mediante plásmidos, vectores víricos (en este caso también se habla de transducción) u otras herramientas para la transferencia. El término transfección para métodos no viralesse usa en referencia a células de mamífero, mientras que el término transformación se prefiere para describir las transferencias no virales de material genético en bacterias y células eucariotas no animales como hongos, algas o plantas.

La transfección de células animales generalmente se lleva a cabo abriendo poros o "agujeros" transitorios en la membrana plasmática de las células mediante electroporación, para permitir el paso del material genético (como construcciones de DNA superenrollado o siRNA) aunque pueden ser transfectadas incluso proteínas (como anticuerpos, por ejemplo). Además de la electroporación, se pueden utilizar otras técnicas para efectuar la transfección, como por ejemplo liposomas producidos mediante la mezcla de lípidos catiónicos con el material genético, que se fusionarán con la membrana plasmática celular y depositarán su carga adentro.

El significado original de "transfección" era "infección por transformación", es decir, introducción de DNA o RNA desde un virus procariótico ó bacteriófago en las células, resultando en una infección. Al tener el término transformación otro sentido en biología celularanimal (un cambio genético que permite la propagación durante largos periodos de células en cultivo, o la adquisición de propiedades típicas de las células cancerígenas), el término transfección adquirió, para células animales, su actual signifiado de cambio en las propiedades celulares por la introducción de material genético.

Técnicas de transfección

  Las técnicas de transfección son la imagen de las técnicas de transformación en procariotas, se basan en la inserción de material exógeno en el genoma de ese organismo.
  Podemos considerar dos grandes grupos de técnicas de transfección, los llamados métodos físicos (se basan en el uso de sistemas mecánicos, no biológicos, para lograr la inserción de material genético en las células) y los métodos químicos.

Las diferencias entre métodos químicos y físicos se encuentran a nivel metodológico, no a nivel de resultados, ya que el conjunto de métodos físicos no se basa en ningún sistema biológico, sino que pretende una inserción a “la fuerza”, de ese material genético. También hay que decir que este conjunto de técnicas sólo es funcional in vitro, ya que es necesaria la exposición de las células a medios extremos.

 Podemos clasificar estos métodos en:
Métodos químicos
                    DNA desnudo
                    Liposomas
Métodos físicos
                    Electroporación
                    Microinyección

TRANSFECCIÓN

Las técnicas de transfección celular, que se han desarrollado fundamentalmente para permitir la introducción de ácidos nucleicos en el interior de las células, han permitido en gran medida ampliar los conocimientos acerca de la regulación génica y de la función de las proteínas en los sistemas celulares. Actualmente se emplean en gran número de aproximaciones experimentales, en la generación de animales transgénicos, en la selección de líneas celulares modificadas, etc...

 La introducción de una construcción de DNA recombinante en la que se ha situado el CDS (secuencia codificante) de un gen  reportero (luciferasa, 'green fluorescent protein', beta-galactosidasa,  cloramfenicol acetiltransferasa -CAT-, etc..) bajo una secuencia de regulación que se desea estudiar permite medir con facilidad tasas de expresión génica en diferentes situaciones experimentales.

Por el contrario, la introducción de un plásmido que contienen la secuencia codificante (CDS) de una proteína de interés bajo el control de un promotor (constitutivo, regulado, etc...) permite la producción de la proteína deseada que puede estar o no etiquetada ('tagged). En este caso se emplea la célula como una factoría de síntesis de proteínas a la que se  le  introduce  en  forma  de  plásmido  la información de la proteína que se desea sintetice.

Tanto en el primero como en el segundo caso puede ser importante seleccionar las células que han adquirido el plásmido. Para facilitarlo se incluyen en éstos genes de resistencia a drogas que permiten a las células que los han adquirido sobrevivir en medios selectivos. Uno de los sistemas de selección más empleado es el de la resistencia a G418 (resistencia a neomicina) que permite seleccionar clones celulares de expresión estable. Así diferenciaremos entre la transfección temporal o transiente y la transfección estable o de larga duración.

9.2 Mecanismos de transferencia artificial: 

Las técnicas de transfección actuales se pueden clasificar en:

MÉTODOS FÍSICOS. 

Basados en la introducción mecánica de las moléculas en el interior de la célula.

  

 MICROINYECCIÓN DIRECTA.

ƒ Es una técnica muy efectiva aunque laboriosa. Es el método que se emplea en la introducción del DNA recombinante en las células embrionarias en el proceso de obtención de animales transgénicos.

 

 ELECTROPORACIÓN.

 

ƒ 'biolistic particle delivery'. Introducción del DNA adherido a micropartículas que se disparan sobre las células. 

Una vez introducida la molécula de DNA recombinante en el interior de las células producirá su efecto permitiendo, por ejemplo :

 Seleccionar células que hayan incorporado el DNA. Este sería el caso del aislamiento de clones celulares que presentaran expresión de un determinado producto. Es posible por la incorporación en el propio vector de marcadores de selección, típicamente la resistencia de G418 (neomicina), ...

 A las pocas horas o días detectar la presencia de la proteína codificada por el plásmido. 

MÉTODOS QUÍMICOS.

 

Basados en la formación de complejos que las células sean capaces de adquirir e incorporar, bien sea directamente mediante la ruta endocítica (fosfato cálcico, DEAE dextrano) o a las membranas (lipofección). 

 

MÉTODO DEL FOSFATO CÁLCICO.

Basado en la obtención de un precipitado entre el cloruro de calcio y el DNA en una solución salina de  fosfatos.

 MÉTODO DEL DEAE DEXTRANO.

 

Basado en la obtención de complejos entre la resina DEAE y el DNA. Los polímeros de DEAE dextrano  o polybreno tienen una carga que les permite unirse a las muy negativamente cargadas moléculas de DNA. El DNA acomplejado se introduce en las células mediante choque osmótico mediante DMSO o glicerol. El uso de DEAE dextrano se limita a las transfecciones transientes.

Método DNA desnudo. El DNA desnudo (técnica en fase altamente experiemtal) es incapaz de entrar en una célula y aún consiguiendo entrar en ellas es rápidamente degradado. La línea de investigación busca incorporar esas secuencias de DNA a un transportador, que le encierra y le lleva hasta la célula Diana en dónde a través de interacciones de membrana se asocia con ella para entregar el material al interior.
  Los problemas que encontramos son que el DNA (rico en cargas -) por ser estructura polar  tiene muchas dificultades para cruzar la membrana plasmática. Además el DNA codificante para  1 gen es aproximadamente de 10 kb, esto representa la longitud aproximada de una célula, en el caso de encontrar el DNA sin ningun tipo de compactatción.


            Método Péptidos fusiogénicos Los  péptidos fusiogénicos surgen en una linea de trabajo que nos permita paliar aquellas características del DNA desnudo que nos impiden la entrada.
 Estos péptidos fusiogénicosa se utilizan para compactar DNA. y de este modo adoptan DNA con proteínas ricas en cargas +, del tipos Histonas. Esto supone una condensación considerable, (visible con MET) ya que el DNA aparece en la forma de partículas de 50-150 nanometros, pero sólo un cierto grado de condensación permite que 1 transportador incluya 1 molécula de DNA. Asimismo la reducción de tamaño del DNA hasta unos 20 nanometros facilitaría el paso a la célula y hasta el núcleo, incrementando su protección contra las nucleases citoplasmáticas. En el proceso de penetración celular, los transportadores sintéticos (si su carga neta es +) interactuan con Aminoazucares de la Membrana plasmáticacon (carga -) para producir la incorporación a la célula en forma de endosomas. Por tanto tenemos un problema más a superar.
También se ha visto que los puntos en dónde se da una mayor transferencia son los pulmones y el hígado, con lo que se considera que los transportadores se agrupan en grandes complejos y que interactuan con proteínas de la sangre, con lo que no abandonan eficazmente el sistema vascular, finalmente son retenidos por los filtros naturales del cuerpo, tales como los pulmones o el hígado, en dónde interactuan.
Esto marca dos puntos a superar en este modelo de transferencia de genes in vivo, en primer lugar el superar los filtros naturales que presenta todo organismo, en segundo punto dirigir el transportador dentro del cuerpo con tal de incrementar la afinidad a las células diana.
Una solución propuesta a este último problema es unirlos a ligandos específicos, tales como azúcares, aminoacidos, hormonas,.... Una vez en el tejido adecuado, el proceso de absorción se da por endocitosis formandose un endosoma (en este punto el transportador con el vector han de salir al citoplasma, ya que si no recibirán ataques lisosomales que digerirán el conjunto). Para conseguir una salida se acopla al vector un péptido fusiogena (p.ej. una molécula DOPE, que permite la salida del endosoma por desestabilitzación de les Mbs).
Des del citoplasma, ahora se tiene que dar la entrada al núcleo, este proceso queda detenido por la envoltura nuclear, con la que el vector sólo puede entrar al núcleo en división, cuando se desorganiza la envoltura nuclear. La envoltura sólo deja pasar por difusión moléculas inferiores a los 9 nanómetros, aunque mediante los transportadores de reconocimiento de la Señal de localización nuclear, podrian entrar moléculas de entre 9-25 nm (los transportadores sintéticos actuales miden más de 25 nm). Lo que nos implica otra nueva dificultad.

MÉTODO DE LIPOFECCIÓN.

 

Se basa en la foamción de complejos entre lípidos catiónicos y DNA. El complejo tiene afinidad por la membrana y permite la entrada del DNA en el citosol. Una de las posibles vías es la incorporación de liposomas a la membrana y la entrada flip-flap. Existen un gran número de lípidos que se emplean en lipofección, aunque existe una estructura consenso de un lípido catiónico sintético, a partir de la cual se han diseñado muchas variantes (por ej. DOPE). Es esencial optimizar las condiciones específicas de transfección para obtener buenas eficiencias, que suelen ser en buenas condiciones de entre el 70 y el 90% de las células de la placa. Las desventajas del método es, aparte del elevado precio de los lípidos, el hecho de que no todos los lípidos funcionan en todos los tipos celulares, y que hay que optimizar el ensayo para cada tipo celular. Los parámetros a optimizar son la relación entre lípido y DNA (relación de cargas), la cantidad de DNA empleado, el tiempo que se exponen las células al complejo y la presencia o ausencia de suero.  Tienes una buena revisión en la página de la Universidad Vanderbilt dedicada a los lípidos catiónicos.  

BIBLIOGRAFIA

http://www.cultek.com/inf/otros/Notas_tecnicas/transfeccion.pdf

http://biologia.uab.es/genetica/curso/EnsayosAlumnos/Christian-Rene/tectrans.html

 http://laguna.fmedic.unam.mx/~evazquez/0403/dna%20material%20genetico1.html

9.1.4 Recombinación.

RECOMBINACIÓN EN VIRUS

La recombinación en virus se descubrió por Delbrück, Bailey y Hershey en 1946. Este hallazgo fue posible a la existencia de variabilidad originada por mutación en caracteres de los virus fácilmente observables en los medios de cultivo. Dentro de este tipo de mutaciones están los caracteres de placa, el rango de hospedador, la sensibilidad a la temperatura, etc..). Entre los caracteres de placa que se pueden analizar están la morfología de las calvas o halos de lisis que producen los virus al matar a las bacterias de cultivo en césped.

Césped de bacterias y calvas o halos de lisis producidos por virus que matan a las bacterias

El primer estudio completo de la recombinación en virus se llevó a cabo por Hershey y Rotman (1949) en el virus T2 analizando virus normales y dobles mutantes. Pare ello utilizaron el sistema de infección mixta en condiciones del alta multiplicidad, consistente en asegurarse de que cada bacteria del medio del cultivo es infectada simultáneamente por los dos tipos de virus, el normal y el doble mutante. Pare ello, se suele realizar la infección de forma que haya cinco veces más de cada uno de los dos tipos de virus que de bacterias. Además, las mutaciones que analizaron en el fago T2 fueron las siguientes:

- Mutantes de lisis rápida (r-) que producen calvas o halos lisis grandes y de bordes nítidos, mientras que los virus T2 normales (r+) dan lugar a calvas pequeñas y de bordes difusos.

- Mutantes (h-) con un distinto rango de hospedador que son capaces de lisar tanto a la cepa B como a la cepa B/2 de E. coli. Los fagos T2 normales solamente lisan o matan a la cepa B de E. coli.

Hershey y Rotman (1949) infectaron simultáneamente con fagos normales (r+h+) y con fagos dobles mutantes (r-h-) un cultivo bacteriano, con los descendientes de esta infección volvieron a infectar un cultivo en césped formado por una mezcla de las cepas B y B/2. Los tipos de calvas o halos de lisis que se observaron fueron los siguientes:

- r-h-: Calvas grandes con bordes nítidos y sin turbidez.

- r+h+:  Calvas pequeñas con bordes difusos y con turbidez.

- r-h+:  Calvas grandes con bordes nítidos y turbidez.

- r+h-: Calvas pequeñas con bordes difusos y sin turbidez.

Tipos de clavas o halos de lisis producidos en un césped de bacterias de las cepas B y B/2

La ausencia de turbidez se debe a que el virus ha matado a los dos tipos de cepas bacterianas la B y la B/2, mientras que la presencia de turbidez se debe a que el virus a matado solamente a la cepa B pero no a la cepa B/2.

En el siguiente esquema se indican los diferentes tipos de virus descendientes y los tipos de calvas o halos de lisis detectados.

Cuando se lleva a cabo la infección mixta anterior, aparecen virus descendientes de tipo parental (dobles mutantes y normales) y virus descendientes de tipo recombinante (r+h- y r-h+). Cada vez que se da un entrecruzamiento entre los loci analizados aparece un virus recombinante r+h- y otro virus r-h+. De forma que el número de virus descendientes r+h- debe ser aproximadamente igual que el de virus r-h+. Lo mismo sucede con los virus de tipo parental, se espera que existan aproximadamente igual cantidad de descendientes r+h+ que de virus r-h-.

Cuanto más lejos estén dos loci en el genoma viral o ADN del virus más probable es que se de un entrecruzamiento entre ambos y la frecuencia de recombinación (Fr) será mayor. Cuanto más cerca estén dos genes menor será la probabilidad de entrecruzamiento y menor será la frecuencia de recombinación.

La forma de estimar la frecuencia de recombinación es, por consiguiente, semejante a la manera empleada en eucariontes. La frecuencia de recombinación es igual a la frecuencia con la que aparecen virus recombinantes en los descendientes multiplicada por cien.

Fr = (Recombinantes/Total) x 100

Problema de los tres puntos en virus: también es posible llevar a cabo infecciones mixtas en condiciones de alta multiplicidad con dos virus que difieran en tres loci, un virus (a⁺ b⁺c⁺) y otro virus (a^- b^-c^-). En estos casos podemos averiguar el locus central y calcular las frecuencias de de recombinación entre los tres loci.

Los razonamientos empleados son semejantes a los descritos en organismos eucariontes. En estas infecciones pueden aparecer ocho tipos de virus descendientes. Se observan virus de tipo parental (a⁺ b⁺c⁺) y (a^- b^-c^-) procedentes de que no se haya dado entrecruzamiento ni en la región I ni en la región II. También hay virus recombinantes solamente en la región I pero no en la II (a⁺ b^-c^-) y (a^- b⁺c⁺). Se encuentran virus procedentes de que solo se haya dado entrecruzamiento en la región II, es decir, recombinantes en la región II que son (a⁺ b⁺c^-) y (a^- b^-c⁺). Por último, se observan virus dobles recombinantes, procedentes de que se haya producido entrecruzamiento en las regiones I y II simultáneamente, como son los virus (a⁺ b^-c⁺) y (a^- b⁺c^-).

Determinación del locus central: los virus dobles recombinantes son los que aparecerán con menor frecuencia, mientras que los virus parentales serán los más frecuentes. Una vez identificados ambas clases de virus, el locus central cumple la propiedad de que el intercambio de alelos en ese locus entre las clases dobles recombinantes reconstruye las ordenaciones parentales. Otra manera de averiguar el locus central es comparar las frecuencias de recombinación (Fr), de forma que la mayor frecuencia de recombinación corresponderá a los loci más alejados.

En el siguiente esquema se indican los tipos de virus descendientes, la determinación del locus central y la estimación de las frecuencias de recombinación entre los tres loci.

Al  igual que sucede en organismos eucariontes, la suma de las frecuencias de recombinación entre el locus central y cada uno de los loci extremos no coincide con la frecuencia de recombinación entre los dos loci extremos. Además, también existe interferencia.

Fr_a-c = Fr_a-b+Fr_b-c-2cFr_a-bFr_b-c

_BIBLIOGRAFIA

http://www.ucm.es/info/genetica/grupod/Recoproc/Recoproc.htm

9.1.3 Transducción

La transducción es un mecanismo de transferencia de genes bacterianos en donde participan virus bacterianos o fagos. Existen dos tipos de transducción:

• Transducción Generalizada: Se produce cuando un segmento de DNA bacteriano es encapsidado por error en una partí­cula viral y ésta infecta una nueva célula. Estos fagos de transducción generalizada pueden contener cualquier porción del DNA bacteriano. 
  
  
• Transducción Especializada: Se produce cuando el DNA que ha sido encapsidado es un hí­brido formado por DNA del fago y de la bacteria, y este virus, luego de la lisis celular, infecta una nueva célula. Los fagos de transducción especializada contienen un fragmento especí­fico del DNA bacteriano.

Transducción Generalizada

	Fijación del fago a la célula
	Inyección del material genético viral
	Degradación del DNA bacteriano y replicación del genoma viral
	Sí­ntesis de las cápsides y empaquetamiento del material genético y viral
	Lisis celular y liberación de partí­culas

La transducción generalizada comienza con el empaquetamiento accidental de una porción del DNA bacteriano en una partí­cula viral normal. Esta partí­cula transductora es liberada por la lisis celular, y es capaz de adherirse a una nueva célula e inyectar el DNA. Después de la inyección en la célula receptora, el DNA transductor puede recombinarse con DNA homólogo de la célula. Los fagos de transducción generalizada más estudiados son el P22 de Salmonella typhimurium y el P1 de Escherichia coli.

El empaquetamiento del DNA viral comienza por sitios especí­ficos del concatámero viral (sitios pac). Estos sitios pac no se encuentran en el genoma bacteriano, pero aparentemente secuencias similares pueden ser reconocidas por el fago y producirí­an la encapsidación errónea del DNA bacteriano. Sitios similares a los sitios pac han sido encontrados tanto en E. coli como en S. typhimurium.

La cantidad de partí­culas de transducción generalizada que pueden producir las células infectadas es muy variable. Mientras algunas células no producen ninguna, otras pueden llegar a encapsidar el 20% del genoma bacteriano. Si bien en este tipo de transducción todas las regiones del DNA bacteriano pueden ser encapsidadas, algunos loci son transducidos con mayor frecuencia.

La transducción generalizada no es un proceso que logra células transductantes con alta eficiencia. Se calcula que aproximadamente el 90% de los DNA bacterianos inyectados por partí­culas de transducción generalizada a células receptoras son abortivos. Esto significa que la información genética introducida no se replica con el genoma de la célula hospedadora y es heredado por una de las células hijas. solamente un bajo porcentaje de DNA donante se asocia con el DNA bacteriano.

El DNA lineal donante inyectado por la partí­cula transductora puede incorporarse de diversas maneras con el DNA bacteriano:

• Incorporación de pequeños fragmentos para producir transductantes por sustitución.
• Incorporación de una de las cadenas para producir un heteroduplex.
• Incorporación de grandes fragmentos.

La transducción generalizada puede obtenerse con fagos temperados o pseudotemperados, y también con fagos virulentos. Los fagos virulentos son los que mayor número de partí­culas transductoras producen, por lo tanto los transductantes potenciales deben ser protegidos de las partí­culas virulentas. Esta protección se logra con una baja multiplicidad de infección y la adición de un antisuero o agente quelante después de la infección inicial para inhibir un nuevo ciclo viral.

Transducción Especializada

	Célula lisogénica: el DNA del fago se encuentra insertado en el DNA bacteriano
	Circularización y escisión del DNA del fago
	Escisión anormal que produce la pérdida de algunos genes del fago, los que se mantienen insertados en el cromosoma bacteriano. En cambio, algunos genes bacterianos han sido tomados junto al DNA del fago
	Degradación del DNA bacteriano y replicación del genoma viral
	Sí­ntesis de las cápsides y empaquetamiento del material genético y viral
	Lisis celular y liberación de partí­culas

La transducción especializada difiere de la generalizada en que sólo un limitado grupo de genes pueden ser transferidos. Estos genes se encuentran flanqueando la región en donde el fago temperado o lisogénico puede integrarse al cromosoma bacteriano. Los fagos temperados como el lambda o phi 80pueden integrar su material genético en sitios especí­ficos del genoma bacteriano. Por ejemplo, el sitio de inserción del fago lambda se encuentra entre los genes gal y bio. Sin embargo, la integración de este fago en sitios de adsorción secundarios puede llevar a la transducción de otros marcadores bacterianos. Estos tipos de fagos sintetizan enzimas de integración y escisión que catalizan la integración del fago en el sitio de adsorción y su correcta escisión. Pero, en algunos casos, pueden ocurrir escisiones anormales que llevan a que parte del genoma del fago lambda se separe junto a genes bacterianos cercanos. Estos eventos producen fagos que no contienen el genoma lambda completo, fagos defectivos, debido a que una región de los genes lambda quedan insertados en el cromosoma bacteriano. Por otra parte, el cromosoma bacteriano pierde algunos genes que son llevados por esta anormal escisión. Estos fagos que contienen genes bacterianos junto al material genético del fago se denominan fagos o partí­culas de transducción especializada.

Los fagos de transducción especializada surgen con una frecuencia muy baja. Los lisados celulares que contienen a los fagos transductores pueden denominarse lisados LFT (Low Frequency Transduction - Transducción de Baja Frecuencia) o lisados HFT (High Frequency Transduction - Transducción de Alta Frecuencia). Generalmente, los lisados HFT son obtenidos a partir de una partí­cula transductora producida por una lisado LFT y de un fago "helper". Este fago "helper" generalmente es necesario para la integración, escisión y/o replicación del fago transductor cuando este es defectivo, ya que aporta las enzimas necesarias que el fago transductor no codifica al haber perdido parte de su genoma. La inducción de estos dobles lisógenos produce lisados HFT que contienen al fago transductor y al fago "helper", y que pueden ser separados mediante gradientes de CsCl debido a diferencias en el tamaño de ambas partí­culas.

Una vez que el fago inyecta el DNA transductante pueden ocurrir diferentes eventos. En todos los casos, después de la inyección, se produce la circularización y superenrrollamiento del DNA transductor. Luego, el DNA viral puede producir la replicación de la progenie viral mediante un ciclo lí­tico, puede mantenerse inactivo y eliminarse por segregación, o puede recombinarse con el material genético bacteriano.

Recombinación del DNA en la transducción especializada

La recombinación del DNA transductor puede ocurrir por tres ví­as diferentes:

Recombinación doble-sitio-especí­fica: Es un caso particular de la recombinación sitio especí­fica. El DNA del fago transductor que contiene el sitio para la integración y en presencia de los adecuados productos genéticos, que generalmente son provistos por el fago "helper", puede sufrir una recombinación doble-sitio-especí­fica con el sitio de fijación del fago en el cromosoma. Generalmente, esto produce un merodiploide (parcialmente diploide) en el DNA bacteriano debido a que éste posee dos copias del mismo gen, una propia y otra insertada con el DNA del fago transductor.

Recombinación por adición: La recombinación entre las dos copias del DNA bacteriano lleva a la incorporación de toda la molécula de DNA del fago transductor y se forma un merodiploide. Los transductantes de adición pueden ser generados simplemente por la formación de ciertos empalmes entre una cadena del DNA transductante y bacteriano (Holliday junction-Empalmes de Holliday) que llevan a la integración del DNA del fago transductor de manera análoga a la integración del transductor por recombinación sitio-especí­fica.

Recombinación por sustitución: La secuencia de información del DNA del fago transductor es transferida al DNA bacteriano sin la incorporación de todo el DNA transductor. Este tipo de transductante es estable y se mantiene haploide.

     La transducción se puede definir como el proceso de transferencia genética desde una célula donadora a otra receptora mediatizado por partículas de bacteriófagos que contienen ADN genómico de la primera. En la transducción podemos distinguir dos estapas diferenciadas:

1.      Formación de la partícula fágica transductora: un trozo de material genético de la célula donadora se introduce en el interior de la cabeza de la cápsida de un fago. Las partículas transductoras son en cierta manera “subproductos” anómalos del ciclo normal del fago.

2.      La partícula transductora inyecta de forma habitual el ADN que porta a la célula receptora, donde este ADN puede eventualmenterecombinarse y expresar su información.

La transducción descubierta por Lederberg y Zinder se llama transducción generalizada.

	Mediante ella se puede transferir cualquier marcador del genóforo del donador, con aproximadamente la misma frecuencia relativa (de ahí el calificativo de generalizada).
	La transducción generalizada se produce sólo como consecuencia de infecciones líticas.
	El ADN del genomio de la bacteria donadora que es introducido en la partícula transductora suele ir sin acompañamiento de ADN del propio fago. Por ello, a esta peculiar partícula consistente en cápsida del fago que encierra sólo ADN genofórico de la bacteria se la denomina pseudovirión.

            Siguiendo con la buena racha de descubrimientos, pocos años más tarde (1956), el mismo Lederberg (esta vez junto con su mujer, y con Morse) hallaron un tipo nuevo de transducción, mientras estaban estudiando el sistema del fago moderado l y su hospedador, E. coli. Este tipo de transducción recibió el nombre de transducción especializada, y sus caracteres distintivos son:

	sólo se transfieren marcadores cromosómicos cercanos al sitio de integración del ADN del fago (profago) en la célula lisogénica (p. ej., en el caso de l, los marcadores gal o bio);
	se produce únicamente como consecuencia de la inducción de la célula lisogénica por escisión del profago y consiguiente entrada a fase lítica, productora de nuevas partículas de fago;
	el ADN genómico de la bacteria transportado por la partícula transductora va unido a ADN del fago;
	la célula transductante se suele convertir en lisogénica para el fago correspondiente.

          TRANSDUCCIÓN GENERALIZADA

            Se caracteriza porque en ella se puede transferir cualquier trozo de genóforo bacteriano, con tal de que tenga un tamaño compatible con la capacidad de “empaquetado” de ADN de la cápsida del fago. La partícula transductora (pseudovirión) se forma por empaquetamiento anómalo de ADN genofórico bacteriano. En el interior de la cabeza del pseudovirión sólo existe ADN bacteriano, sin ADN del fago. Las partículas transductoras sólo se forman como consecuencia de infecciones líticas del fago.

Mecanismo de la transducción generalizada promovida por el fago P22 de S. typhimurium.

1ª fase: producción de las partículas fágicas transductoras (=pseudoviriones): Por encapsidamiento ilegítimo de ADN cromosómico. De vez en cuando, el sistema fágico encargado de introducir su ADN en la cápsida (sistema pac), se “equivoca”, y en su lugar introduce un trozo de tamaño equivalente del genóforo de la bacteria donde está teniendo lugar la infección .

            Al parecer, el cromosoma bacteriano contiene secuencias que eventualmente pueden ser reconocidas de vez en cuando por el sistema del fago, de manera que puede introducirse un trozo de ADN de Salmonella en la cápsida.

            Al final de esta fase, la célula hospedadora se lisa. El lisado (sobrenadante) contiene una mayoría de viriones auténticos y un pequeño número de pseudoviriones, cada uno con un trozo aleatorio distinto del genomio de la bacteria.

2ª fase: Destino del ADN del exogenote: Mezclemos el lisado obtenido en la fase anterior con un cultivo de la cepa receptora (dotada de marcadores genéticos adecuados). Cada pseudovirión inyecta de forma normal su ADN a una bacteria. Este ADN puede tener varios destinos posibles:

a)      puede ser destruido por exo- y endonucleasas citoplásmicas.

b)      Puede recombinarse con la región homóloga del genóforo del receptor, mediante la actuación del sistema de recombinación general dependiente de RecA. Se produce una recombinación con dos sobrecruzamientos (“crossing-overs”), que conduce a la integración de doble cadena de ese exogenote, con eliminación de la zona homóloga del endogenote.

c)      Puede ocurrir que el exogenote no sea ni destruido ni recombinado; este ADN puede persistir en la célula sin replicarse. La consecuencia de esto es que cuando la célula que originalmente recibió ese ADN exógeno se divida, lo pasará solo a una de las dos células hijas, la cual a su vez la pasará a una hija en la siguiente división, y así sucesivamente. Tenemos, pues, que el exogenote se va diluyendo en el clon por transmisión unilinear: tras varias generaciones, el clon consta de n-1 células sin exogenote y una sola célula con ese exogenote. A este fenómeno se le conoce con el nombre de transducción abortiva, y es más frecuente que la transducción completa derivada de recombinación (más de 90% frente a sólo 1-5%).

La célula que alberga el exogenote abortivo puede expresar los genes de éste: por lo tanto, la célula transductante abortiva contiene proteínas derivadas del exogenote. Parte de las proteínas (en principio la mitad), pasarán a la célula hija que no reciba el exogenote en la siguiente generación. Las hijas de la hija (“las nietas no herederas del original”) reciben la cuarta parte, etc... es decir, aparte de la célula hija que en cada generación hereda el exogenote, sus parientes no-herederos más cercanos reciben proteínas derivadas de la expresión previa de los genes del exogenote. Esto significa que las células no herederas pueden poseer, durante unas pocas generaciones, la función o funciones del exogenote, hasta que el producto correspondiente se diluya o se inactive.

Esto permite detectar fácilmente determinados tipos de transductantes abortivos, distinguiéndolos de los transductantes completos. Por ejemplo, si estamos seleccionando transductantes en base a la adquisición, por parte de una cepa receptora auxotrofa, de la versión silvestre del gen que tiene mutado, sembrando en placas de Petri con medio mínimo, se distinguen dos dos tipos de colonias:

	colonias grandes, correspondientes a transductantes completos;
	microcolonias, correspondientes a los transductantes abortivos.

d)      Si el exogenote es un plásmido, al llegar a la célula receptora, puede replicarse autónomamente.

e)      Si el exogenote contiene un transposón, éste puede insertarse en el genoma de la célula receptora.

            No todos los fagos virulentos pueden actuar como mediadores de transducción generalizada. Los fagos con esta capacidad suelen ser aquellos que no degradan totalmente el ADN del hospedador inmediatamente después de entrar (de otra manera, no habría ADN intacto que transducir). Además, su sistema de empaquetamiento de ADN no debe ser muy específico: fagos como el P22 de Salmonella typhimurium o el P1 de Escherichia coli tienen un mecanismo de empaquetado secuencial de unidades de concatémeros, mecanismo que reconoce secuencias que también existen con cierta frecuencia en el genoma del hospedador.

             La transducción generalizada ha sido muy útil en el análisis genético de bacterias y la construcción de nuevas cepas. El alumno seguramente estudiará en la asignatura de Genética algunas aplicaciones, incluida la elaboración de mapas de ligamiento. En las prácticas de Virología del Departamento de Microbiología de la Facultad de Ciencias los estudiantes realizan un interesante experimento de co-transducción que permite aplicar algunas de estas ideas.

         TRANSDUCCIÓN ESPECIALIZADA (=RESTRINGIDA)

            Recordemos que fue descubierta por el equipo de Lederberg (1956), mientras hacían experimentos de inducción de células de E. colilisogenizadas con el fago l. Este tipo de transducción consiste en la transferencia -mediatizada por fagos moderados producidos en la inducción de un cultivo lisogénico-, de un número limitado de marcadores, correspondientes a los loci genéticos adyacentes al sitio de integración del profago. La transducción restringida nunca ocurre por infecciones líticas. El ADN transducido va unido a ADN del fago.

Mecanismo de la transducción especializada promovida por el fago l de Escherichia coli

1ª fase: Producción de los fagos transductores: Supongamos una cepa silvestre de E. coli K12 (l⁺), o sea, lisogénica para el fago l. Como ya sabemos, el profago se encuentra integrado entre los operones gal y bio.

Inducimos artificialmente este cultivo lisogénico (tratando, p. ej., con rayos UV, o con mitomicina-C). El profago desreprime sus funciones vegetativas, de modo que va a entrar en un ciclo lítico, comenzando por escindirse del lugar de integración, por medio de una recombinación específica conservativa entre sus extremos (BOP' X POB'). Con una baja frecuencia (10-5-10--6) se producen escisiones anómalas del profago: bucles anómalos, de modo que se forman círculos que llevan una porción adyacente del cromosoma bacteriano (dependiendo de los casos, o gal o bio), y en cambio, queda un trozo del genomio del fago. De esta forma se pueden formar fagos l defectivos (ld) para alguna función fágica, pero con la “contrapartida” de ser portadores de material genofórico de la bacteria hospedadora.

Así pues, de esta forma se obtiene un lisado (llamado lisado LTF, de baja frecuencia de transducción), donde existe una pequeña proporción (alrededor de 10--6) de partículas defectivas del fago portadoras de ADN cromosómico. Estos viriones, por sí solos no podrían establecer lisogenia, pero si en una misma célula inyectaran su ADN un fago defectivo y otro silvestre, este último actuaría como fago auxiliador (“helper”) de modo que el defectivo sí podría entonces establecer lisogenia. A continuación veremos precisamente cada una de estas dos posibilidades. (En ambos casos vamos a suponer que las partículas transductoras portan el operón silvestre gal+, y que empleamos una cepa receptora mutante gal--).

2ª fase en el caso de infectar una cepa receptora con el lisado anterior a baja multiplicidad de infección: Imaginemos que mezclamos un cultivo de la cepa receptora con un lisado LTF, a una multiplicidad de infección (m.d.i., o en inglés, m.o.i) de alrededor de 1 (o sea, cada bacteria recibe, por término medio una sola partícula de fago).

Una partícula lgal+ inyectaría de forma normal su ADN en la bacteria gal--. El ADN lineal del fago se circulariza como de costumbre. Pero obsérvese que este ADN no posee un sitio att normal, sino que presenta solamente el sitio BOP' (derivado de la escisión anómala producida en el ciclo anterior), y además, al ser defectivo, cabe la posibilidad de que haya perdido el gen int que codifica la integrasa. En este caso, la única posibilidad de integración del ADN es mediante recombinación homóloga simple (un solo crossing-over) propiciada por el sistema RecA de la bacteria receptora.

El resultado de esta recombinación homóloga es la creación de un heterogenote gal+/gal-- con un profago l defectivo, que debido a ese carácter defectivo no es inducible (no provoca lisogenia). Observar que cada copia del gen gal es en realidad un “mosaico”, con una porción derivada del exogenote y otra del endogenote. Este heterogenote con fenotipo Gal+ es estable.

2ª fase en el caso de infectar la cepa receptora con el lisado LTF a una alta multiplicidad de infección: Imagimenos ahora que mezclamos una media de 10 partículas de fago del lisado obtenido en la primera fase con 1 célula de la bacteria receptora (o sea, una m.o.i.=10).

	Algunas bacterias reciben el ADN del fago defectivo (ldgal+) junto con el ADN del fago silvestre.
	El ADN del fago silvestre se integraría de la forma habitual, mediante su sistema de recombinación específica de sitio (POP' X BOB'). Este ADN del fago silvestre actúa como auxiliador respecto del defectivo: le suministra sitios para la recombinación y la función de la integrasa. Por lo tanto, a continuación se produce otro evento de recombinación específica entre ambos ADN de l.
	El resultado es un heterogenote gal+/gal-- que es doble lisogénico (l+/ld). Su fenotipo sería Gal+ y l+, capaz de producir, por inducción partículas de fago silvestres y defectivas.
	Supongamos que inducimos ahora este clon doble lisógeno: se producen dos bucles en cada célula, uno que regenera el genomio circular del l silvestre, y otro que origina el de ldgal+. Observar, pues, que el resultado de esta inducción es un lisado donde existe un 50% de l+y un 50% de fagos portadores del gen gal+. Si este lisado lo usamos para infectar de nuevo una cepa gal--, la proporción de transductantes Gal+ será muy alta. Por esta razón, al lisado obtenido por inducción del doble lisógeno l+/ld se le denomina lisado HTF(alta frecuencia de transducción).

La transducción especializada con el fago l permitió los primeros aislamientos (“clonaciones”) de genes in vivo, pero por supuesto, desde mediados de los años 70 la clonación de genes se realiza ya con métodos de ADN recombinante (ingeniería genética).

BIBLIOGRAFIA

http://www.ugr.es/~eianez/Microbiologia/19transduccion.htm

http://datoanuncios.org/?a=21192