Conceptos básicos de biología molecular, II
Ácidos nucleicos
Los organismo vivientes contienen dos clases de ácidos
nucleicos: ácido ribonucleico (ARN) y ácido
desoxirribonucleico (ADN)
Las moléculas de ADN están formadas por dos cadenas de
moléculas más simples llamadas hebras (strands)
Cada hebra tiene un esqueleto consistente en repeticiones de la
misma unidad básica llama nucleótido
Esta unidad está formada por una molécula de azúcar llamada
20desoxiriibosa, un grupo fosfato y una base nitrogenada
La molécula de azúcar contiene 5 átomos de Carbono
etiquetados 10 a 50
El enlace que crea el esqueleto está entre el Carbono 30 de un
nucleótido, el grupo fosfato y el Carbono 50 del nucleótido
siguiente.
En cada Carbono 10 del esqueleto se encuentra enlazada una base
nitrogenada: Adenina (A), Timina (T), Citosina (C) o Guanina (G)
Las bases A y G pertenecen a un grupo más grande de substancias llamadas purinas Mientras que las bases C y T pertenecen a las pirimidinas Aun cuando las bases y los nucleótidos no son lo mismo, cuandohablamos del tamaño de una molécula de ADN podemos decir porconvención que tiene por ejemplo 200 bases o 200 nucleótidos
Las moléculas de ADN en la naturaleza son muy largas, mucho más que las proteínas En una célula humana, puede tener cientos de millones de nucleótido
Ø Como ya hemos mencionado las moléculas de ADN se componen de dos cadenas o hebras.
Ø Las dos hebras se enroscan sobre sí mismas formando una especie de escalera de caracol, denominada doble hélice.
Ø Esta estructura fue propuesta en 1953 por James Watson y Francis Crick1
Ø El éxito de éste modelo radicó en su consistencia con las propiedades físicas y químicas del ADN.
Ø Watson y Crick demostraron que las dos hebras de ADN están enlazadas entre sí porque cada base en una cadena está apareada (enlazada) con una base de la otra cadena.
Ø La base A siempre está enlazada con la base T y la base G con C Por esta razón decimos que A y T son bases complementarias al igual que G y C.
Estos pares de bases son conocidos como pares de bases Watson-Crick
Los pares de bases constituyen la unidad de longitud más utilizada para referirnos a las moléculas de ADN (100kbp)
Durante este curso generalmente consideraremos el ADN como una cadena de caracteres, donde cada carácter representa una base
Por ejemplo la doble hebra de una secuencia de ADN puede ser representada de la siguiente forma:
50 _ _ _ TACTGAA _ _ _ 30
30 _ _ _ ATGACTT _ _ _ 50
Observemos que el extremo 30 de una hebra corresponde al 50 de la otra
Esta propiedad se conoce como antiparalelismo de las hebras.
La consecuencia fundamental de esta estructura es que es posible inferir la secuencia de una hebra dada la otra La operación que permite realizar esto es llamada
complementación inversa Por ejemplo dada la hebra s = AGACGT en la dirección canónica
se realiza lo siguiente para obtener su complemento inverso:Se invierte s, obteniendo s0 = TGCAGA
Se remplaza cada base por su complemento s = ACGTCT
Es precisamente este mecanismo que permite al ADN en una célula la replicación
Por lo tanto también permite a un organismo que inicia su vida como una célula crecer hasta contener millones de células
Donde cada una de estas células tiene una copia de las moléculas de ADN de la célula original
En organismos procariotas (bacterias y arqueas) cuyas células notienen un núcleo, el ADN se encuentra flotando libre dentro de cada célula
En organismos eucariotas (animales, plantas, y hongos) el ADN se encuentra dentro del núcleo y en los elementos celulares llamados mitocondrias (animales y plantas) y plastos (sólo plantas)
Las moléculas de ARN son muy similares a las de ADN, con las siguientes diferencias básicas de composición y estructura:
Ø En el ARN la molécula de azúcar es ribosa y no 20desoxiriibosa
Ø En el ARN no encontramos la base Timina (T); en vez de eso el
Uracilo (U) está presente (U-A)
El ARN no forma una doble hélice (una sola hebra lineal)
Ø Otra diferencia es que el ADN realiza sólo una función (codificar información), mientras que como veremos puede haber diferentes tipos de ARN en la célula, desarrollando diferentes funciones.
1.1 EL DESARROLLO DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR.
1.1.1 El descubrimiento del principio transformante.
· EXPERIMENTOS DE GRIFFITH (1928)
El descubrimiento de la trasformación.
En 1928 en el transcurso de sus experimentos con la bacteria Streptococcus pneumoniae, Frederick Griffith había hecho una misteriosa observación. Esta bacteria humana causante de la neumonía humana, es normalmente letal para los ratones. Sin embargo, han aparecido diferentes cepas que difieren en su virulencia. Griffith utilizo en sus experimentos dos cepas que se distingan por la apariencia de las colonias crecidas en laboratorio. Las células de una de las cepas, de tipo virulento normal, están rodeadas por una cápsula de polisacáridos que le da a la colonia apariencia lisa (smooth en ingles); de ahí llamada estirpe S. Las células de la otra cepa (un tipo mutante) no virulento que se reproduce en los ratones pero no es letal, carecen de esta cápsula de polisacáridos, lo cual hace que las colonias tengan apariencia rugosa; esta es la denominada estirpe R.
Griffith mato algunas células virulentas, hirviéndolas e inyecto las células muertas en ratones. Los ratones sobrevivieron, demostrando así que las cápsulas de las células no provocan la muerte.
Sin embargo, ratones inyectados con una mezcla de células no virulentas vivas y células virulentas muertas, murieron. Además podían recuperarse bacterias vivas de los ratones muertos; esta producían colonias lisas y en subsiguientes inyecciones eran virulentas. De alguna manera, los restos celulares de las células S hervidas habían convertido a las células S vivas. Este proceso se denomina transformación.
Conclusión: Los experimentos de Griffith demostraron que la transformación ocurría por la absorción por parte de células vivas (estirpe R) de un “principio trasformante” que se encontraba en las células muertas (Estirpe S). Ese principio trasformante tenia la característica de producir una cápsula de polisacáridos (se expresaba) y producía además la muerte en ratones, en otras palabras estaban confiriendo propiedades hereditarias a la celula recipiente, ese principio trasformante se sabría después que eran moléculas de DNA.
· EXPERIMENTOS DE AVERY Y COLABORADORES (1944)
Este mismo método básico se utilizó para determinar la composición del “principio trasformante.
En 1944, Oswald Avery, C. MacLeod y M. McCarty separaron los distintos tipos de moléculas que se encuentran en las células S muertas y estudiaron su capacidad de transformación por separado.
Estas pruebas demostraron, en primer lugar, que los propios polisacáridos no trasformaban a las células rugosas. Por tanto la cubierta de polisacáridos, aunque claramente implicada en la acción patogénica, es solo la expresión fenotípica de la virulencia. Tras el escrutinio de los diferentes compuestos (Polisacáridos, Lípidos, RNA, Proteínas y DNA), Avery y col. Descubrieron que solo DNA, inducía la transformación de las células R, dedujeron que el DNA es el agente que determina la aparición del polisacárido y, por tanto, del carácter patogénico. Es mas, parece ser que proveer a las células R del DNA de las células S es equivalente a ¡proveerlas de los genes de las células S!!
· EXPERIMENTOS DE HERSEY Y CHASE (1952)
Los experimentos llevados a cabo por Avery eran definitivos, pero muchos científicos se resistieron a aceptar como material genético al DNA (y no a las proteínas). La prueba definitiva se obtuvo en 1952 por Alfred Hersey y Martha Chase, usando el fago (virus T2). su razonamiento fue que la infección del fago debe implicar la introducción dentro de la bacteria de la información que dicta la reproducción viral. El fago es relativamente simple en cuanto a la composición molecular.
Estructura y partes de un Fago T2
La mayor parte de la estructura de un fago es proteína, estando el DNA en el interior de la envuelta proteica o “cabeza”.
En las proteínas no se encuentra fósforo, que si forma parte del DNA; inversamente, el azufre esta presente e las proteínas pero nunca en el DNA.
Hersey y Chase marcaron el DNA del fago con un radioisótopo del fósforo (P32) y las proteínas con azufre (S35), en cultivos distintos de fagos. Usaron entonces cada cultivo por separado, para infectar E. coli con muchas partículas de virus por cada célula.
Tras dejar tiempo suficiente para que se produjera la infección, separaron de las células bacterianas las carcasas vacías de los fagos llamadas “fantasmas” mediante agitación con una batidora de cocina.
Separaron las células bacterianas de los fantasmas de los fagos, mediante centrifugación, y midieron entonces la radioactividad en las dos fracciones. Cuando se usaron los fagos con P32, la mayor parte de la radioactividad terminaba en las células bacterianas, indicando que el DNA viral entraba en las células. También podía recuperarse P32 de los fagos descendientes. Cuando se usaron fagos los fagos marcados con S35, la mayor parte de la radiactividad terminaba en los fantasmas virales, indicando que la proteína viral nunca entra en la célula bacteriana.
La conclusión es evidente!: El DNA es el material hereditario; las proteínas fágicas son meros empaquetadores estructurales que se desechan después de inyectar el vital DNA en la célula bacteriana.
1.1.2 El descubrimiento de la estructura del ADN.
Después de que el papel central del DNA en la herencia se hizo evidente, muchos científicos se dispusieron a determinar su estructura con exactitud. ¿Como puede una molécula con un rango tan limitado de componentes distintos almacenar la inmensa variedad informativa de las estructura de todas las proteínas de los seres vivos?
Los primeros que tuvieron éxito en descubrir la estructura fueron Watson y Crick en 1953- tuvieron en cuenta dos tipos de pistas. En primer lugar, Rosalind Franklin y Maurice Wilkins, habían acumulado muchos datos de difracción de rayos X sobre la estructura de DNA.
Difracción de rayos x
El segundo tipo de datos procedía del trabajo de años antes de Edwin Chargaff. Estudio DNA de diferentes organismos, Chargaff estableció ciertas reglas empíricas sobre las cantidades de cada componente del DNA:
Erwin Chargaff analizó la composición de bases de distintos organismos y encontró distintas proporciones de los 4 nucleótidos en cada uno de los organismos estudiados. También observó que esta composición no cambiaba con la edad ni el ambiente. Pero lo más importante es que había tantas purinas como pirimidinas en todos los organismos. Las reglas de Chargaff son:
1. la cantidad total de nucleótidos pirimidinicos (T + C) es siempre igual a al cantidad total de nucleótidos púricos (A + G).
2. la cantidad de T es siempre igual a la de A y la cantidad de C es siempre igual a la de G. pero A + T no necesariamente es igual a C+G
En los primeros análisis de difracción de R-X realizados por Rosalyn Franklin se observaba que el DNA tenía un espaciado regular de 0,34 nm. Éste y otros indicios indicaban que debe tener algún tipo de estructura en hélice que se repite periódicamente, los datos sugerían que el DNA era largo y fino y que consta de dos partes separadas que corre una al lado de la otra a lo largo de la molécula, también demostraba que la molécula era helicoidal.
Watson y Crick construyeron un modelo que cumpliera todas las investigaciones que sobre el DNA se habían realizado hasta la fecha y propusieron, además, cómo tenía que conservarse y transmitirse la información de esta molécula. También introdujeron que esta molécula se podía mutagenizar espontáneamente mediante la tautomería.
Se pueden consultar los artículos publicados por Watson y Crick, Wilkins y Franklin en Nature el 25 de abril de 1953 para describir la estructura del DNA. También puedes leer las implicaciones que Watson y Crick dedujeron de la estructura del DNA publicadas el 3 de mayo del 53, así como la demostración experimental que Frankin aportó el 25 de julio del 53 para confirmar que la doble hélice era realmente así.
1.1.3 El descubrimiento del código genético.
Desde que se demostró que las proteínas eran producto de los genes, y que cada gen estaba formado por fracciones de cadenas de ADN, los científicos llegaron a la conclusión de que debe haber un código genético mediante el cual el orden de las cuatro bases nitrogenadas en el ADN podría determinar la secuencia de aminoácidos en la formación de polipéptidos. En otras palabras, debe haber un proceso mediante el cual las bases nitrogenadas transmitan la información que dicta la síntesis de proteínas.
La estructura tridimensional de la molécula de ADN fue demostrada por James D. Watson y Francis Crick en 1953. Pero faltaba averiguar cómo interpreta el organismo la secuencia de las distintas bases que forman la estructura lineal del ADN para sintetizar las cadenas de aminoácidos de las proteínas. La solución a este enigma, el código genético, se halló en 1966 gracias a la colaboración entre numerosos investigadores, entre ellos Marshall Nirenberg.
Diez años después de que Watson y Crick determinaran la estructura del ADN, el código genético fue descifrado y verificado. Su solución dependió en gran medida de las investigaciones llevadas a cabo sobre otro grupo de ácidos nucleicos, los ácidos ribonucleicos (ARN). Se observó que la obtención de un polipéptido a partir del ADN se producía de forma indirecta a través de una molécula intermedia conocida como ARN mensajero (ARNm).
El código genético asocia a cada triplete de bases del ADN, llamado codón, un aminoácido concreto. Con los cuatro tipos de bases (U, uracilo; A, adenina; G, guanina; y C, citosina) que forman la molécula de ARN, sintetizada de manera complementaria a partir de la de ADN, se pueden formar 64 tripletes distintos (por ejemplo, UAC, UGG y AUC, entre otros). Cada codón se atribuye a un aminoácido concreto de los veinte posibles sin ninguna ambigüedad. Como hay menos aminoácidos que codones, algunos de aquéllos quedan designados por varios de éstos. Así, los seis tripletes UUA, UUG, CUU, CUC, CUA y CUG designan el aminoácido leucina y los dos AGU y AGC la serina; en cambio, el triptófano queda designado por un solo codón, UGG. La mayor parte de los aminoácidos están determinados de manera casi unívoca por sus dos primeras bases y, en muchos casos, el tercer nucleótido es un complemento indiferente o designa otro aminoácido de una familia próxima. Esta propiedad contribuye a limitar las consecuencias de los errores de copia o lectura.
La forma en que la clave genética fue descifrada – como se determinaron los aminoácidos concretos representados por cada triplete- constituye una de la aventuras biológicas mas apasionantes en las ultimas décadas. Una vez que estuvieron disponibles las técnicas experimentales adecuadas, la clave genética se descifro en un suspiro.
Numero de letras de cada codón: se partió del hecho de que la clave debería ser de 3 letras; porque? Si la clave fuera de una letra (nucleótido : A, G, C, U) solo habría cuatro aminoácidos diferentes (4 letras diferentes). La clave genética no podría ser asi, pr que se necesitaría una distinta para cada uno de los 20 aminacidos!
Si la clave fuera de 2 letras, entonces seria posible 42 = 16; por ejemplo, AU, CU o CC, este vocabulario no seria todavía suficientemente variado.
Si la clave fuera de 3 letras, entonces seria posible 43 = 64; por ejemplo AUU, GCC o UGC. Esta clave ofrece mas combinaciones que las necesarias para los aminoácidos.
Y hacia 1961 parecía claro que estos codones no eran solapados.
El primer paso para el desciframiento fue el descubrimiento de cómo fabricar RNAm sintético. Si los nucleótidos que conforman el RNA se mezclan con una enzima especial (fosforilasa de los polinucleotidos) se forma una cadena sencilla de RNA de la reacción. Esta síntesis no requiere ADN y los nucleotidos se incorporan al azar. La capacidad de sintetizar RNA habria la posibilidad de crear secuencias especificas de ARN y comprobar que aminoácidos se incorporaban al utilizarlas como RNAm.
El primer mensajero sintético obtenido, Poli(U), se fabrico mezclando solo nucleótidos de U, produciendo asi –UUUUUUUU-.
En 1961 Marshal Nirenberg y Heinrich Mathaei mezclaron in vitro Poli (u) y la maquina sintetizadora de proteínas de E. coli (Ribosomas, RNAt, energía, varias enzimas y algunas cosas mas) y observaron la formación de una proteína!! Resultando como secuencia de proteína ser una ristra de Fenilalanina. Así pues, el triplete UUU debe ser el codon de fenilalanina.
U U U U U U U U U U U U
- Phe - Phe - Phe -Phe -
Este tipo de análisis se amplio mezclando diferentes tipos de nucleótidos, en proporciones fijas conocidas. En un experimento los nucleótidos Uracilo y Guanina se mezclaron en razón 3:1. al incorporase los nucleótidos al azar en el RNAm sintético, la frecuencia relativa con la que aparece. hacia 1966 con Severo Ochoa ya se había descifrado los codones de los 20 aminoácidos
¿Por qué tal reticencia en aceptar esta conclusión?? El DNA se consideraba un compuesto más bien simple. ¿Cómo podría una molécula tan simple almacenar toda la información que se requiere para la enorme variedad de estructuras proteicas
? ¿Cómo podría trasmitirse tal información de una generación a la siguiente? Sin duda, el material genético debe poseer tanto la capacidad de poner en clave la información especifica como la de duplicar tal información precisa. ¿Qué tipo de estructura en una molécula tan simple, podría explicar unas funciones tan complejas?
1.2 LA BIOLOGÍA MOLECULAR EN MÉXICO.
La biología molecular nace formalmente en 1953, con la publicación del modelo estructural del ácido desoxirribonucleico ADN o, de manera universal, DNA por sus siglas en inglés propuesto por James Watson, Maurice Wilkins, Rosalind Franklin y Francis Crick. En ese entonces también se fraguaba, de manera por demás importante, el concepto de que la biología obedecía a fenómenos físicos y químicos cuantificables; esto es, que la biología no era meramente una disciplina descriptiva sino también cuantitativa. Es así que el inicio de la biología molecular fue influido en gran medida por los físicos, destacando Max Delbruck, quien se dedicó a la genética después de una trayectoria en la física teórica y quien estimuló a otro físico, Erwin Schrodinger, a escribir su importante libro ¿Qué es la vida?
La biología molecular nace, asimismo, de la bioquímica. La bioquímica en sí, se gestó dentro del pensamiento cuantitativo, particularmente con la visión de que la vida se podía explicar a través de una serie de reacciones químicas, catalizadas por enzimas. Así se construyeron los grandes esquemas de las vías metabólicas que incluyen, entre otros muchos, el ciclo de Krebs, el ciclo de la urea, la cadena respiratoria, la biosíntesis de ácidos grasos, de las hormonas, y de las vitaminas y la fotosíntesis.
El inicio de la biología molecular en México
Como en todo el mundo, la biología molecular en México nació de la bioquímica. La Sociedad Mexicana de Bioquímica había sido fundada el primero de julio de 1957, por doce visionarios de la ciencia mexicana. Sin embargo, entre ese grupo no había biólogos moleculares, más que nada porque la disciplina no había nacido formalmente en los planes de estudio de las universidades, aunque se considera que su inicio fue en 1953, con el reporte de James Watson y Francis Crick sobre la estructura del ácido desoxirribonucleico (DNA).
Previamente a este trabajo, Edwin Chargaff había realizado los estudios más completos sobre la composición bioquímica del DNA y Oswald T. Avery y colaboradores las primeras observaciones sobre la transformación del pneumococo, lo cual revelaba la importancia de la función del DNA. En 1957, se estaban realizando los primeros estudios relativos a descifrar el código genético, por Marshall Nirenberg, Severo Ochoa, y H.G. Khorana, y la estructura de los ribosomas y el RNA (ácido ribonucleico) ribosomal, mensajero, y de transferencia, por Masayasu Nomura, entre otros muchos; así como las primeras descripciones del modo de replicación del DNA por Matthew Meselson y Frank Stahl, y el concepto del operón por Francois Jacob y Jacques Monod. Más aun, en la escuela de estructura y cristalografía de Cambridge, Max Perutz y colaboradores revelaban las formas de las primeras proteínas que se estudiaron.
Por esto, no es de extrañar que varios grupos de investigación científica en México, empezaran a interesarse seriamente en la biología molecular sino hasta principios de la década de 1970.
1.3 Perspectivas futuras de la Biología Molecular.
Después de que los científicos lograron identificar el ADN como la molécula que contiene la mayoría, si no toda, de la información genética de una célula el mero campo de la geneática molecular avanzo rápidamente a finales de la decada de los años 50 y principios de los años 60 proporcionado nuevos conceptos a una velocidad que solo puede compararse con la del desarrollo de al mecánica cuántica de los años 20. el éxito inicial y la acumulación de una gran cantidad de información permitieron a los investigadores aplicar las técnicas y los moderno métodos biológicos de la genética molecular.
Las aplicaciones de la biología molecular y campo de estudio
· Estudios en investigación molecular básica y aplicada:
· Clonación genética e hibridación
· Tecnología del ADN Recombinante o ingeniería genética (organismos transgenicos)
· Reacción en Cadena de la Polimerasa (RCP)
· Aislamiento de DNA y RNA (Southern y Northern)
· La tecnología denominada huella de ADN (DNA fingerprinting)
· Procedimiento denominado secuenciación de ADN
· Terapia génica
· Genes interrumpidos (Knock out)
· Control de la expresión génica
· Terapia germinal (células madres)
· Creación de genotecas (bibliotecas de ADN)
· Taxonomia genética y evolucionismo
· Otros.
El estudio del ADN también ayuda a los taxónomos a establecer las relaciones evolutivas entre animales, plantas y otras formas de vida, ya que las especies más cercanas filogenéticamente presentan moléculas de ADN más semejantes entre sí que cuando se comparan con especies más distantes evolutivamente. Por ejemplo, los buitres americanos están más emparentados con las cigüeñas que con los buitres europeos, asiáticos o africanos, a pesar de que morfológicamente y etológicamente son más similares a estos últimos.
La agricultura y la ganadería se valen ahora de técnicas de manipulación de ADN conocidas como ingeniería genética y biotecnología. Las estirpes de plantas cultivadas a las que se han transferido genes pueden rendir cosechas mayores o ser más resistentes a los insectos. También los animales se han sometido a intervenciones de este tipo para obtener razas con mayor producción de leche o de carne o razas de cerdo más ricas en carne y con menos grasa.
Huella de DNA
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